KLINIČNA UPORABNOST MOLEKULARNIH METOD DOKAZOVANJA POVZROČITELJEV INFEKCIJSKIH DRISK PRI ODRASLIHKotar, Tadeja (Avtor) Lejko Zupanc, Tatjana (Mentor) Pirš, Mateja (Komentor) infekcijska driskamolekularna diagnostikaCt vrednostiodraslibris rektumaIzhodišča in namen dela Z molekularnim diagnosticiranjem in s sindromskim naborom mikrobioloških preiskav (tj. s hkratnim pregledom blata na bakterije, viruse in parazite) se število drisk, ki jih vzročno ne uspemo pojasniti, pomembno zmanjša. Kljub temu ostaja še veliko odprtih vprašanj glede tolmačenja izvidov in njihove uporabnosti pri kliničnem delu. O razširjenosti (prevalenci) enteropatogenov v zdravi, brezsimptomni populaciji vemo malo, zato klinična vrednost teh najdb še ni jasna. V svetovni literaturi podatkov, ki bi neposredno primerjali rezultate v skupini bolnikov in rezultate v kontrolni skupini, ni veliko. Tudi poznavanje vrednosti pražnega cikla (angl. cycle of threshold, Ct) pri verižni reakciji s polimerazo v realnem času (angl. polymerase chain reaction, PCR) za posamezne mikroorganizme v vzorcih odraslih bolnikov z drisko in v vzorcih kontrolnih oseb ter opredelitev vloge Ct pri tolmačenju mikrobioloških izvidov za zdaj (še) nista zadovoljivi. Vzorec blata, odvzet v standardne posodice, je metoda izbire pri pridobivanju kužnine za dokaz enteričnih patogenov. Ker v določenih okoliščinah blata ne moremo dobiti že ob pregledu, bi kot alternativni način odvzema kužnine lahko uporabili bris rektuma. Večino raziskav o uporabnosti brisa rektuma so doslej opravili pri otrocih, medtem ko je podatkov o uporabnosti brisa rektuma za dokazovanje povzročitelja infekcijskih drisk pri odraslih za zdaj malo. Z raziskavo smo želeli opredeliti klinično uporabnost molekularnih diagnostičnih pristopov pri dokazovanju povzročiteljev infekcijske driske pri odraslih. Zanimalo nas je, katere potencialne povzročitelje driske dokažemo v vzorcih odraslih bolnikov z drisko in v vzorcih odraslih kontrolnih oseb brez črevesnih simptomov ter kako pogosto. Želeli smo tudi ugotoviti, ali se količina nukleinske kisline (DNK), opredeljena z vrednostjo pražnega cikla, za posamezne mikroorganizme v vzorcih bolnikov z drisko in vzorcih kontrolnih oseb razlikuje. V nalogi smo skušali opredeliti tudi uporabnost vzorca, ki smo ga pridobili s krtačastim brisom rektuma (krtačasti bris v transportnem gojišču Cary-Blair), saj zelo poenostavi pridobitev kužnin.&#8195; Hipoteze H1: Z molekularnim diagnosticiranjem bomo tudi pri kontrolni skupini oseb dokazali mikroorganizme, ki so potencialni povzročitelji infekcijske driske. Pričakujemo, da bomo pri kontrolnih osebah v vzorcih blata dokazali manjšo količino nukleinske kisline posameznih mikroorganizmov (opredeljeno z vrednostjo pražnega cikla) kot v vzorcih blata bolnikov z drisko ter opredelili tiste vrednosti pražnega cikla, pri katerih lahko sklepamo na klinično pomemben rezultat. H2: Število etiološko pojasnjenih drisk se statistično pomembno ne razlkuje, če za opredelitev povzročiteljev infekcijske driske (kot nadomestilo za vzorec blata) uporabimo krtačasti bris rektuma v transportnem gojišču Cary-Blair. Preiskovanci in metode V prospektivno raziskavo primerov in kontrol smo vključili 334 bolnikov obeh spolov, starih 18 let ali več in brez znanih imunskih okvar, ki smo jih od junija 2016 do avgusta 2017 zaradi driske pregledali na Kliniki za infekcijske bolezni in vročinska stanja (KIBVS) v Ljubljani in so zaradi resnosti bolezni potrebovali bolnišnično obravnavo (dnevna bolnišnica, bolnišnično zdravljenje), ter 154 kontrolnih oseb. Kontrolna skupina je vključevala osebe, ki v zadnjih štirih tednih pred vključitvijo niso imele driske in smo jih na KIBVS pregledali zaradi drugih težav, ter zdrave prostovoljce. Drisk, pridobljenih v bolnišnici, v naši raziskavi nismo spremljali. Bolnikov z drisko, ki so HIV-pozitivni ali s presajenimi organi zaradi večje homogenosti skupine v raziskavo nismo vključili. Za namen raziskave so bolniki oddali vzorec blata in bris rektuma, kontrolne osebe pa samo vzorec blata. Dodatne podatke smo pridobili na osnovi odgovorov v vprašalniku. Poleg mikrobioloških preiskav blata za dokaz povzročiteljev infekcijskih drisk – ki jih danes izvajamo rutinsko ter vključujejo kombinacijo metod kultivacije in neposrednega dokazovanja povzročiteljev z dokazom DNK ali antigenov – smo mikroorganizme dokazovali tudi z molekularnimi diagnostičnimi metodami. Pristopili smo »sindromsko«, saj smo s preiskavami hkrati dokazovali viruse, bakterije in parazite. Primerjali smo rezultate preiskav v vzorcih blata bolnikov in vzorcih blata kontrolnih oseb ter rezultate mikrobioloških preiskav vzorcev blata in brisov rektuma pri bolnikih. &#8195; Rezultati V končno analizo smo vključili 304 bolnike, pri katerih smo pridobili parne vzorce brisov rektuma in vzorcev blata, ter 154 oseb brez prebavnih težav (kontrolna skupina). Z uporabo molekularnega diagnosticiranja pri dokazovanju povzročiteljev infekcijske driske v blatu se je delež etiološko opredeljenih drisk z 51,3 % (sedaj uporabljene metode) povečal na 64,5 % (PCR). Z molekularnim testiranjem smo vsaj en patogen dokazali pri 196 od 304 bolnikov (stopnja pozitivnosti 64,5 %; 95 % IZ 58,8–69,9) in pri 20 od 154 kontrolnih oseb (stopnja pozitivnosti 13 %; 95 % IZ 8,1–19,3). V kontrolni skupini smo dokazali statistično pomembno manj patogenov (p < 0,005). Razmerje obetov (RO) je bilo 12,16 (95 % IZ 7,19–20,56). Več kot en patogen smo dokazali pri 23 od 304 bolnikov (7,6 %) (pri 21 bolnikih dva patogena, pri dveh bolnikih tri patogene) in pri dveh od 154 kontrolnih oseb (1,3 %). S primerjavo vrednosti pražnega cikla (Ct) pri bolnikih in pri kontrolnih osebah smo pri večini patogenov ugotovili višje vrednosti v kontrolni skupini (kar posredno odraža nižjo količino patogenov). Med bolniki in kontrolnimi osebami je bilo prisotno znatno prekrivanje v vrednostih Ct. Jasne mejne vrednosti Ct, ki bi bila tudi klinično pomembna, za posamezen patogen nismo uspeli opredeliti. Z uporabo molekularnega diagnosticiranja (hkratni PCR v realnem času) smo med 304 parnimi vzorci vsaj en patogen (v brisu rektuma in/ali v vzorcu blata) dokazali pri 226 bolnikih (74,3 %). Najmanj en patogen smo dokazali v 196 vzorcih blata (64,5 %) in v 193 brisih rektuma (63,5 %). Skladen rezultat je bil prisoten pri 241 od 304 bolnikov (79,3 %). Oba vzorca sta bila pozitivna za vsaj en patogen pri 163 bolnikih (53,6 %) in oba negativna pri 78 bolnikih (25,7 %). Pri 33 bolnikih (10,9 %) je bil pozitiven samo vzorec blata, pri 30 bolnikih (9,9 %) pa samo bris rektuma. Ob uporabi sindromskega molekularnega pristopa je bila celokupna občutljivost rektalnega brisa glede na vzorec blata kot zlati standard 83,2 % (95 % IZ 77,2–88,1), celokupna specifičnost pa 72,2 % (95 % IZ 62,8–80,4). Povprečne vrednosti Ct so bile za večino patogenov pri rektalnem brisu višje kot v vzorcu blata. Stopnja skladnosti rezultatov med kulturo in PCR (izražena s Cohenovo vrednostjo kappa (&#954;)) je bila dobra pri vzorcih blata (&#954; 0,798; 95 % IZ 0,730–0,867) in zmerna pri rektalnih brisih (&#954; 0,592; 95 % IZ 0,505–0,680). Ob uporabi molekularnega testiranja je bila občutljivost rektalnih brisov za bakterije 86,5 %, ob uporabi kulture za bakterije pa 61,4 %. Zaključki Z vpeljevanjem občutljivih molekularnih diagnostičnih metod je dilema glede pomena dokazane virusne nukleinske kisline v vzorcu blata – torej vprašanje, ali je dokaz potencialnega patogena v blatu dovolj za opredelitev povzročitelja driske – postala bistveno večja. V raziskavi smo ugotovili, da je razširjenost (prevalenca) enteropatogenov v blatu brezsimptomnih oseb pri odraslih manjša kot pri otrocih (glede na podatke iz literature). Podatki o količini DNK posameznih mikroorganizmov, ocenjeni z vrednostjo pražnega cikla (Ct), v vzorcih blata bolnikov z drisko in v vzorcih blata kontrolnih oseb ne pomagajo pri kliničnem tolmačenju izvidov molekularnih preiskav blata pri odraslih. V raziskavi smo pokazali, da je krtačasti bris rektuma v transportnem gojišču Cary-Blair sicer sprejemljiva alternativna možnost odvzema kužnine, če bolnik ob pregledu vzorca blata ne more oddati, a zahteva uporabo molekularnega diagnosticiranja. Ker so bili pri uporabi kulture bakterij brisi rektuma pomembno manj občutljivi od vzorcev blata, menimo, da pri brisih rektuma uporaba bakterijske kulture ni primerna.20192019-04-03 07:45:36Doktorsko delo/naloga107356VisID: 11533COBISS_ID: 299586816sl