Načrtovanje in razvoj peptidnih ligandov za afinitetno čiščenje protitelesKruljec, Nika (Avtor) Bratkovič, Tomaž (Mentor) afinitetna kromatografijaizolacija in čiščenje protitelespeptidipredstavitev na bakteriofaguMonoklonska protitelesa spadajo med najpomembnejše biološke učinkovine s širokim razponom terapevtskih indikacij. Prvi korak v izolaciji in čiščenju monoklonskih protiteles je njihovo zajetje iz procesne tekočine z afinitetno kromatografijo. V ta namen najpogosteje uporabljamo bakterijske imunoglobulin-vezavne proteine (npr. stafilokokni protein A, SpA). Slednji imajo številne slabe lastnosti, zaradi česar obstaja vse večja težnja po razvoju novih afinitetnih ligandov. Eno izmed perspektivnejših skupin alternativnih ligandov predstavljajo peptidi. V okviru doktorskega dela smo s presejanjem kombinatoričnih bakteriofagnih predstavitvenih knjižnic peptidov identificirali skupino peptidnih ligandov z afiniteto do fragmenta Fc imunoglobulinov G. Med petimi peptidnimi vezalci z dvema različnima aminokislinskima motivoma se je z najboljšimi vezavnimi lastnostmi izkazal peptidni ligand 19Fc. Na osnovi kompeticije s SpA za vezavo na regijo Fc predvidevamo, da se vezavno mesto peptidnega liganda nahaja na stiku domen CH2 in CH3. Z namenom določitve minimalnega motiva in ključnih aminokislinskih ostankov peptida 19Fc za vezavo na fragment Fc smo skrajšali peptid na N- in/ali C-koncu ter izvedli alaninsko rešetanje. Kot rezultat smo dobili minimalizirano različico peptidnega liganda, poimenovano min19Fc. Interakcijo med sinteznim biotiniliranim peptidom b-min19Fc ter humanim fragmentom Fc smo potrdili s pomočjo površinske plazmonske resonance (SPR). V nadaljevanju smo s ciljem povečanja topnosti ter morebitnega povečanja občutljivosti interakcije min19Fc-regija Fc na spremembe vrednosti pH v peptidu min19Fc zamenjali za vezavo neesencialen aminokislinski ostanek z nabitimi aminokislinami (glutamat, aspartat in lizin). Mutantam smo ovrednotili afiniteto vezave do različnih podrazredov humanih IgG ter določenih terapevtskih monoklonskih protiteles. Nadalje smo pripravili dve skupini peptidnih mutant z zamenjavami izbranih aminokislinskih ostankov s sorodnimi ter s slednjimi skušali pridobiti boljši vpogled v odnos med strukturo in vezavnimi lastnosti peptidov. Interakcijo izbranega peptidnega afinitetnega liganda min19Fc ter izboljšane mutante min19Fc Q6D do humanih IgG smo ovrednotili tudi z mikrotermoforezo (MST). Sposobnost izolacije in čiščenja protiteles s sinteznimi peptidi smo ocenili s testi »pull down«. Tako smo simulirali pogoje, podobne tistim, ki so jim protitelesa izpostavljena pri potovanju skozi afinitetno kromatografsko kolono. Končni cilj doktorskega dela je bila priprava afinitetne kromatografske kolone z izbranim peptidnim ligandom, min19Fc Q6D. Sintezni peptid smo prek kratkega distančnika vezali na sefarozni matriks, aktiviran s cianogen bromidom. Tako pripravljena kolona je izkazovala dinamično vezavno kapaciteto 11 mg IgG/mL afinitetnega nosilca. Iz kompleksnih zmesi, kot sta celično gojišče in humani serum, smo izolirali hIgG z ocenjeno čistoto, ki presega 95 %, ter s tem potrdili visoko specifičnost afinitetne kolone. Izpostavili smo jo več kot petindvajsetim poskusom izolacije hIgG in pri tem nismo zaznali znatnega zmanjšanja funkcionalnosti. Med preizkušenimi pogoji zaprtega čiščenja kromatografske kolone smo uporabili tudi raztopino 6 M gvanidinijevega klorida, 30 % izopropanol ter 1 M NaOH, kar ni bistveno vplivalo na kapaciteto afinitetne kolone, s čimer smo potrdili stabilnost razvite afinitetne kolone. Učinkovito elucijo IgG iz kolone smo dosegli z glicinskim pufrom s pH 2,5.20192019-04-03 07:45:01Doktorsko delo/naloga107353VisID: 11531COBISS_ID: 3972116sl