Sinteza in vrednotenje fluoroforov s fenoksazinskimi in kumarinskimi skeleti, primernih za fluorescenčno mikroskopijo membran s stimulirano emisijoNovak, Matej (Avtor) Pajk, Stane (Mentor) membranske sondeSTEDsuper-ločljivostkumarinfenoksazinSTED nanoskopija je super-ločljivostna mikroskopska metoda, ki se uporablja v naravoslovnih znanostih za opazovanje struktur, ki so manjše od difrakcijske omejitve svetlobe, kar je glavna prednost glede na klasičen fluorescentni mikroskop. Predpogoj za STED pa so primerne fluorescenčne sonde, ki omogočajo metodi selektivno vklapljanje in izklapljanje fluorescence, ki v tem trenutku predstavljajo največjo oviro tej metodi. V magistrski nalogi smo načrtovali in sintetizirali fluorescenčne sonde, ki bi omogočale selektivno označevanje celičnih membran. Sonde temeljijo na fenoksazinskem in kumarinskem skeletu, ki pripadata že znanim fluoroforom. Številni fluorofori na podlagi omenjenih skeletov še niso bili preizkušeni pri STED nanoskopiji. Na osnovne skelete smo pripeli funkcionalne skupine, ki omogočijo sondam umeščanje v membrane. V okviru te naloge smo preizkusili in optimizirali reakcije in sintetizirali večje število potencialnih sond. Vsem smo izmerili ekscitacijske in emisijske spektre, na podlagi katerih smo povezali vpliv strukture na foto-fizikalne lastnosti. Izbrane sonde, to so PNMb-8, PNMb-9, PNMaw-2, PNMbw-2, PNMkb-2, PNMpb-2 in PNMpa-2, smo poslali na Institut Jožef Stefan, kjer so jih uporabili v preizkusu na STED. S sondami so označili biološke vzorce in jih ocenili glede na selektivnost porazdeljevanja med celičnimi membranami, emisijo pod pogoji STEDa, fotostabilnostjo in citotoksičnostjo. Sintetizirane sonde dobro označijo plazemsko membrano, vendar hitro poteče internalizacija do drugih celičnih membran. Najbolj je izstopala sonda PNMpa-2, ki omogoča pridobitev odličnih super-ločljivih slik, ni citotoksična in je zelo fotostabilna, tudi v primerjavi s komercialno dostopnimi sondami. Sonda temelji na kumarinskem skeletu z N-metilpiridinsko skupino na mestu 3 in predstavlja dobro izhodišče za nadaljnji razvoj primernih sond. Največja pomanjkljivost fenoksazinskih sond, kot je PNMbw-2, je omejena fotostabilnost in bi jih bilo smiselno razvijati v smeri izboljšanja na tem področju. Kljub temu, da sonda PNMbw-2 zaradi fotobledenja ni primerna za večkratno zajemanje slike, so le te izjemne ločljivosti. Sonda PNMb-9 pa je izkazovala citotoksičnost kljub zelo ostrim STED slikam in zanemarljivemu fotobledenju. Ali je to značilnost vseh 4-cianokumarinov, bi morali potrditi s testiranjem dodatnih sond.20192019-03-21 08:35:01Magistrsko delo/naloga106849VisID: 67096sl