Pridobivanje proteinov minimalnega kompleksa poliketid-sintaze genske skupine za biosintezo oksitetraciklina v Streptomyces sp.Kobale, Valerija (Avtor) Petković, Hrvoje (Mentor) Kranjc, Luka (Komentor) streptomiceteStreptomyces rimosusoksitetraciklinpoliketid sintazeizražanje proteinovstabilnost plazmidovOsnovno ogrodje molekule oksitetraciklina (OTC), ki ga sintetizira bakterija S. rimosus, sintetizirajo encimi zgodnje stopnje biosinteze, ki pripadajo kompleksu minimalnih poliketid sintaz (mPKS); to so ketosintaza-α (OxyA), ketosintaza-β (OxyB) in acil-prenašalni protein (OxyC). Ker mehanizmi začetnih reakcij v biosintezi OTC še niso docela pojasnjeni, bi bilo za razumevanje katalitične aktivnosti encimov potrebno pridobiti vse encime tega kompleksa in postaviti in vitro testni sistem, ki omogoča rekonstrukcijo in karakterizacijo aktivnosti individualnih komponent. Namen magistrske naloge je bil priprava topnih proteinov mPKS. Poskus priprave topnih proteinov mPKS je bil v E. coli neuspešen, zato smo v okviru naloge transformirali plazmide pVF s konstrukti za izražanje posameznih genov oxyA, oxyB in oxyC v sev S. rimosus, ki ne sintetizira OTC (∆OTC). Pridobljenim klonom transformant S. rimosus ∆OTC s plazmidi pVF s konstrukti posameznih genov oxyA, oxyB in oxyC ni bilo mogoče meriti aktivnosti, zato smo ustreznost klonov preverili z metodo ponovne transformacije v E. coli DH10β (»plasmid rescue«). Izkazalo se je, da so plazmidi pVF s konstrukti posameznih genov oxyA, oxyB in oxyC nestabilni, kar se je izkazalo tudi v spremenjeni morfologiji kolonij transformant S. rimosus ∆OTC. Delež klonov S. rimosus ∆OTC z ustreznimi plazmidi pVF s konstrukti posameznih genov oxyA in oxyC je bil nižji od 15 %, medtem ko ustreznih klonov s plazmidi pVF s konstrukti gena oxyB nismo uspeli potrditi. Z afinitetno kromatografijo in elektroforezo SDS-PAGE smo identificirali klone S. rimosus ∆OTC z ustreznim plazmidom pVF srT oxyA 3'HT, ki proizvajajo protein velikosti 45 kDa, ki najverjetneje ustreza proteinu ketosintazi-α. Z metodo točkovnega prenosa smo pridobili pozitiven signal, s tem smo dodatno potrdili prisotnost nekaterih ciljnih proteinov.[V. Kobale]20182018-09-08 07:47:29Magistrsko delo/naloga102828UDK: 602.3+602.6+604.4:579.873.7VisID: 155141COBISS_ID: 4941944sl