Vzpostavitev metode za ugotavljanje prisotnosti genov sitA, traT in ompT pri sevih Escherichia coli iz perutnineLotrič, Marjetka (Avtor) Avguštin, Gorazd (Mentor) Kogovšek, Polona (Komentor) Escherichia colisevi APECbakterijske bolezniperutninakolibacilozamolekularne metodez zanko posredovano izotermalno pomnoževanje DNALAMPgen sitAgen traTgen ompTKolibaciloza je najpogostejša bakterijska bolezen pri perutnini in se pogosto konča s poginom živali, zaradi česar nastanejo velike ekonomske izgube. Kolibacilozo povzroča za perutnino patogena bakterija Escherichia coli (APEC). Bolezenski znaki so zelo različni. Sevi APEC povzročajo primarne kot tudi sekundarne okužbe ptic. Vse determinante patogenosti sevov APEC še niso popolnoma pojasnjene, zato sta nadzor nad tovrstnimi okužbami in identifikacija povzročitelja bolezni zahtevna. Trenutno so v uporabi tradicionalne diagnostične metode, ki so časovno zamudne in pogosto cenovno neugodne. Zaradi vse večjih potreb po hitri diagnostiki v ospredje prihajajo molekularne metode, med katerimi sta tudi verižna reakcija s polimerazo - PCR (ang. polymerase chain reaction) in z zanko posredovano izotermalno pomnoževanje - LAMP (ang. loop mediated isothermal amplification). Glavni namen naloge je bil razvoj metode, na osnovi LAMP, ki bi omogočala učinkovito ugotavljanje prisotnosti virulentnih genov pri sevih APEC. Razvili smo teste LAMP-APEC za ugotavljanje prisotnosti genov sitA, traT in ompT, ki se pogosto pojavljajo med virulentnimi sevi. V ta namen smo oblikovali šest kompletov začetnih oligonukleotidov za pomnoževanje teh treh tarčnih genov z LAMP in med njimi izbrali najboljše. Z LAMP dobljene rezultate smo primerjali z rezultati, ki smo jih dobili s PCR in ugotovili smo, da so rezultati obeh metod primerljivi. Pripravili smo protokol priprave različnih vzorcev (tkiva notranjih organov, stelja, krma, iztrebki in zrak), v katerih lahko neposredno potrdimo prisotnost virulentnih genov, brez predhodne osamitve DNA. Z metodo LAMP smo v času krajšem od 30 minut potrdili prisotnost vseh treh genov v različnih vzorcih. Dokazali smo tudi, da je metoda LAMP neobčutljiva za snovi, ki zavirajo potek reakcije PCR in so sicer prisotne v bioloških vzorcih. LAMP se je izkazala za specifično, robustno, selektivno, občutljivo, hitro in enostavno diagnostično metodo za odkrivanje izbranih genov virulentnih dejavnikov sevov APEC. Njena velika odlika je možnost uporabe na terenu.[M. Lotrič]20182018-09-08 07:45:22Magistrsko delo/naloga102774UDK: 579.62:579.842:577.213.3VisID: 155126COBISS_ID: 4942200sl