Prilagoditev doze obsevalne terapije pri humanem ploščatoceličnem karcinomu ustnega žrela okuženim s humanim virusom papiloma in vitro in in vivoPrevc, Ajda (Avtor) Serša, Gregor (Mentor) Strojan, Primož (Komentor) Humani virus papilomaploščatocelični karcinom ustnega žrelaradiokemoterapijaprilagoditev doze obsevanjaZnanstveno izhodišče: Humani virus papiloma (HPV) je eden pomembnejših povzročiteljev ploščatoceličnega karcinoma ustnega žrela. Opazili so, da HPV-pozitivni ploščatocelični karcinomi ustnega žrela bolje odgovorijo na sočasno radiokemoterapijo s terapevtiki na osnovi platine od HPV-negativnih ploščatoceličnih karcinomov ustnega žrela. To je vzbudilo razmišljanje o znižanju intenzivnosti radioterapije pri teh bolnikih. Pogoj je ohranitev deleža ozdravitev, ki je dosežen s konvencionalnimi dozami obsevanja (frakcionirano obsevanje, skupna doza obsevanja 70 Gy) in sistemskih terapevtikov, namen pa zmanjšanje neželenih stranskih učinkov zdravljenja. Do sedaj opravljene raziskave kažejo, da so boljši rezultati zdravljenja HPV-pozitivnih ploščatoceličnih karcinomov ustnega žrela posledica večje občutljivosti teh tumorjev na radioterapijo in nekatere sistemske terapevtike, ki se uporabljajo za zdravljenje bolnikov s HPV-pozitivnimi tumorji ploščatoceličnega karcinoma ustnega žrela. Molekularni mehanizmi povečane občutljivosti HPV-pozitivnih celic ploščatoceličnega karcinoma ustnega žrela na radioterapijo in izbrane sistemske kemoterapevtike na osnovi platine niso popolnoma jasni, verjetno pa temeljijo na slabšem popravilu DNA. Predklinične raziskave mehanizmov delovanja radioterapije na HPV-pozitivnih tumorskih modelih so redke. Še redkejše so predklinične raziskave odziva HPV-pozitivnih tumorskih modelov ploščatoceličnega karcinoma ustnega žrela na kombinacijo obsevanja in sistemske kemoterapije s cisplatinom, ki bi omogočale boljše načrtovanje zdravljenja. Namen in hipoteze: Namen doktorske naloge je bil ugotoviti, za koliko lahko pri HPV-pozitivnih tumorjih (v primerjavi s HPV-negativnimi tumorji) zmanjšamo dozo obsevanja, ne da bi s tem zmanjšali učinek zdravljenja. Naše hipoteze so bile, da je v kombinaciji s cisplatinom radiosenzitivnost HPV-pozitivnih tumorskih celic ploščatoceličnega karcinoma ustnega žrela in vitro večja od radiosenzitivnosti HPV-negativnih tumorskih celic ploščatoceličnega karcinoma ustnega žrela; da je radiosenzitivnost HPV-pozitivnih tumorskih celic večja zaradi zmanjšanega delovanja popravljalnih mehanizmov DNA; ter da se lahko pri HPV-pozitivnih mišjih tumorskih modelih ploščatoceličnega karcinoma ustnega žrela enak delež ozdravitve kot pri HPV-negativnih mišjih tumorskih modelih doseže z nižjo dozo obsevanja ob sočasni terapiji s cisplatinom. Metode: V raziskavah in vitro smo s pomočjo testa klonogenosti določili stopnjo občutljivosti HPV-pozitivne (2A3) in HPV-negativne (FaDu) tumorske celične linije na obsevanje, terapijo s ciplatinom in kombinacijo obeh. Ovrednotili smo razliko v deležu in časovni dinamiki popravila poškodb DNA med HPV-pozitivnimi in HPV-negativnimi tumorskimi celicami in vitro. Določili smo stopnjo eno- in dvoverižnih prelomov DNA (kometni test) in tvorbo žarišč fosforiliranih histonov γH2AX na DNA (ki označujejo dvoverižne prelome DNA) po obsevanju, terapiji s ciplatinom in kombinaciji obeh. Obenem smo spremljali tudi pojav posredovanega učinka sevanja (ang. bystander effect) po obsevanju HPV-pozitivnih in HPV-negativnih celic (ob sočasni terapiji s cisplatinom). Dodatno smo preverili še morfologijo celic po obsevanju v kombinaciji s cisplatinom ter ovrednotili delež apoptotičnih in mitotičnih celic. Poleg tega smo s pomočjo pretočne citometrije preverili spremembe v poteku celičnega cikla po terapiji. Isti humani tumorski celični liniji kot v poskusih in vitro smo uporabili za indukcijo tumorjev na imunsko oslabljenih laboratorijskih miših (SCID). S testom zaostanka v rasti tumorjev smo preverili odziv obeh tumorskih modelov na obsevanje ter na sočasno terapijo s cisplatinom. Določili smo tudi faktor modificiranja doze obsevanja ob sočasni terapiji s cisplatinom pri HPV-pozitivnih tumorjih za dosego enakega učinka zdravljenja kot pri HPV-negativnih tumorjih s standardnimi dozami. Rezultati: Tako v in vitro poskusih kot tudi na tumorskem modelu in vivo smo pokazali, da so HPV-pozitivne celice oziroma tumorji bolj občutljivi na samo obsevanje kot HPV-negativne celice in tumorji. Na samo terapijo z nizkimi dozami cisplatina sta bili obe tumorski celični liniji v raziskavi in vitro enako občutljivi. Tudi potenciacija učinka obsevanja z dodajanjem cisplatina je bila in vitro prisotna pri obeh tumorskih celičnih linijah. V raziskavi in vivo je bila učinkovitost dodanega cisplatina večja pri HPV-negativnih tumorjih, vendar je bil skupni učinek še vedno večji pri HPV-pozitivnih tumorjih. Faktor modificiranja doze, izračunan s primerjavo učinkovitosti obsevanja oziroma kombinirane terapije glede na HPV status tumorja, je znašal 1,3 oziroma 1,2, kar pomeni, da so HPV-pozitivni tumorji za 30 % bolje odgovorili na radioterapijo ter za 20 % bolje na kombinirano terapijo kot HPV-negativni tumorji. Ugotovili smo, da je prišlo pri HPV-pozitivnih celicah po samem obsevanju in po kombinirani terapiji do večjega deleža dvoverižnih prelomov DNA, ki so se v primerjavi s prelomi pri HPV-negativnih celicah tudi počasneje popravili. Z morfološko analizo celic smo pri kombinirani terapiji in vitro pri HPV-pozitivnih celicah opazili večji delež apoptotičnih in manjši delež mitotičnih kot pri HPV-negativnih celicah, analiza celičnega cikla pa je pri HPV-pozitivnih celicah pa terapiji pokazala zaustavitev celičnega cikla v fazi G2/M. Posredovane učinke sevanja smo opazili le pri HPV-pozitivnih celicah po kombinirani terapiji. Zaključki: V raziskavi smo potrdili, da so HPV-pozitivne celice in tumorji bolj občutljivi na obsevanje kot HPV-negativni tumorji ter da ima sočasna terapija s cisplatinom aditiven učinek ne glede na HPV status. Na podlagi rezultatov lahko predlagamo 20 % znižanje doze obsevanja pri kombinirani terapiji s cisplatinom pri HPV-pozitivnih tumorjih ploščatoceličnega karcinoma ustnega žrela, pri čemer bi dosegli enako učinkovitost kot jo dosežemo s standardno dozo pri radiokemoterapiji HPV-negativnih tumorjev. Rezultati raziskave in vitro so pokazali, da je povečana občutljivost na terapijo med drugim posledica višje ravni poškodb DNA, nižje stopnje popravila teh poškodb, zaustavitve celičnega cikla v fazi G2/M in višje stopnje apoptoze.20182018-09-05 07:15:08Doktorsko delo/naloga102587VisID: 10420COBISS_ID: 297155584sl