Določanje izražanja in aktivne domene encima pernizin v bakterijah vrste Escherichia coli.Hartman, Kevin (Avtor) Poklar Ulrih, Nataša (Mentor) pernizinhipertermofilni encimiAeropyrum pernixsubtilizinu podobne proteinazerekombinantno izražanjeEscherichia coliavtokatalitično zorenjeavtoproteolizaPernizin je zunajcelična serinska proteinaza, ki jo sintetizira hipertermofilna arheja Aeropyrum pernix. Za razvoj komercialnih aplikacij in nadaljnji opis pernizina je ključen razvoj učinkovitega rekombinantnega ekspresijskega sistema. Kodonsko optimizirano zaporedje za pernizin smo vstavili v vektorje pMCSG7 in pMD204, s tem smo pripravili ekspresijske vektorje za prekomerno izražanje gena za pernizin v Escherichia coli. Optimalna čistost pernizina je bila dosežena z usmerjeno akumulacijo encima v periplazmi. Po izolaciji iz periplazemske frakcije in čiščenju encima označenega s histidinsko značko z Ni-NTA afinitetno kromatografijo je bil dosežen donos ~4 mg pernizina na L produkcijske kulture. Za aktivacijo encimske aktivnosti pernizina je potrebna avtokatalitična odcepitev proregije. Glede na predvidena cepitvena mesta post-translacijskega zorenja smo sintetizirali neprocesiran pernizin (Prn1), encim brez signalne sekvence (Prn26) ter procesiran encim brez proregije (Prn92 ; Prn94). S cimografijo smo potrdili uspešno zvitje vseh različic rekombinantnega pernizina v proteolitično aktivno obliko. To nakazuje, da proregija pri pernizinu ni nujna za uspešno zvitje, kot velja za nekatere subtilaze. S CD-spektropolarimetrijo in fluorescenčno emisijsko spektrometrijo smo potrdili visoko termostabilnost rekombinantnega pernizina ter pokazali visoko encimsko aktivnost pri temperaturi 100 °C z azokazeinskimi testi. Ugotovili smo, da med postopki produkcije in biokemijske karakterizacije v vzorcih pernizina poteka nezaželena avtoproteoliza. Vezava kalcijevih ionov (Ca2+) povzroči konformacijske spremembe v strukturi pernizina, verjetno preko tvorbe Ca2+-vezavne zanke. Vezava kalcijevih ionov zviša konformacijsko stabilnost in proteolitično aktivnost, kar posledično zviša tudi stopnjo avtokatalitičnega zorenja in avtoproteolize v raztopinah pernizina.[K. Hartman]20182018-06-20 07:45:16Magistrsko delo/naloga101592UDK: 604.4:577.15:602.44:543.544.17(043.2)VisID: 151335COBISS_ID: 8993657sl