Proučevanje prirojenega imunskega odziva po okužbi z virusom Dobrava in virusom PuumalaResman Rus, Katarina (Avtor) Avšič Županc, Tatjana (Mentor) virus Dobravavirus PuumalaHMRSIFN tipa Iprofil PBMCHMGB1hemoragična mrzlica z renalnim sindromomhantavirusne okužbemononuklearni levkocitihantavirusimunski spominalergija in imunologijavirologijaV Sloveniji hemoragično mrzlico z renalnim sindromom (HMRS) povzročajo hantavirusi Dobrava (DOB), Puumala (PUU) in Dobrava-Kurkino. Potek bolezni je lahko zelo različen, od blage oblike bolezni, do bolezni s težkim potekom, ki se lahko konča tudi s smrtnim izidom. Dosedanje raziskave kažejo na to, da ima pri okužbi s hantavirusi pomembno vlogo odgovor prirojenega imunskega sistema gostitelja. Pokazali so, da patogeni hantavirusi zavirajo zgodnji odziv interferonov tipa I (IFNα in IFNβ), stopnja zaviranja IFN pa je odvisna od stopnje patogenosti hantavirusa. Utišanje prirojenega imunskega odziva posledično privede do hitrega in nenadzorovanega, sistemskega razsoja okužbe. V dostopni literaturi še ni opisanih razlik v prirojenem imunskem odzivu po okužbi z virusom DOB in virusom PUU. V naši raziskavi smo želeli ugotoviti ali obstajajo razlike v prirojenem imunskem odzivu mononuklearnih celic iz periferne krvi (PBMC) pridobljenih iz kliničnih vzorcev bolnikov po okužbi z virusom DOB in virusom PUU ter njihov pomen v patogenezi HMRS. Doktorsko nalogo smo razdelili na tri dele. V prvem delu raziskave smo želeli ugotoviti, ali obstajajo razlike v odzivu IFN tipa I pri PBMC po stimulaciji z virusom DOB in virusom PUU ter ali razlike v odzivu IFN tipa I vplivajo na različen potek bolezni. Z virusom DOB in virusom PUU smo stimulirali PBMC zdravih prostovoljcev in PBMC bolnikov z znanim potekom HMRS. Ugotovili smo, da virus PUU, ne pa virus DOB, stimulira odziv IFN tip I, saj je bilo izražanje genov IFNβ, STAT-1 in MxA 48 ur po stimulaciji statistično značilno večje kot pri nestimuliranih celicah. Z rezultati raziskave smo potrdili postavljeno hipotezo, da je stopnja odziva IFN tipa I po stimulaciji PBMC z virusom DOB nižja kot po stimulaciji z virusom PUU, kar posledično lahko pripomore k težji klinični sliki HMRS po okužbi z virusom DOB. S stimulacijo PBMC iz vzorcev bolnikov po preboleli HMRS smo ugotovili, da je izražanje gena MxA pri PBMC bolnikov, ki so imeli blažji potek okužbe z virusom PUU statistično značilno višje, kot pri PBMC bolnikov, ki so imeli težji potek okužbe. Iz rezultatov naše raziskave sklepamo, da večje protivirusno delovanje, ki smo ga potrdili z višjim izražanjem gena MxA, pripomore k blažjemu poteku okužbe z virusom PUU. Odziv PBMC pridobljenih iz akutnih vzorcev bolnikov smo primerjali z odzivom PBMC, ki smo jih pridobili iz vzorcev bolnikov po preboleli HMRS, saj nas je zanimala vloga imunskega spomina. Predpostavljali smo, da bo odziv IFN tipa I je bolj zavrt v PBMC med akutno okužbo kot v PBMC po preboleli okužbi. Statistično značilne razlike so se pokazale med PBMC bolnikov, ki so imeli težji potek okužbe z virusom PUU. Ugotovili smo, da je izražanje gena IFNβ statistično značilno nižje, izražanje gena MxA pa statistično značilno višje pri akutnih PBMC, kot pri PBMC po preboleli okužbi. Iz rezultatov sklepamo, da so PBMC pridobljeni v akutni fazi HMRS bolj odzivni na stimulacijo z virusom PUU, kot PBMC pridobljeni po preboleli bolezni. Menimo, da odziv IFN tipa I pri PBMC ne prispeva k zaščiti pred ponovno okužbo z virusom DOB in virusom PUU, saj je del prirojenega imunskega sistema, ki na patogene deluje z nespecifičnimi odgovori. V drugem delu doktorske naloge smo s pretočno citometrijo primerjali profil PBMC bolnikov s HMRS. Želeli smo ugotoviti, ali okužba z virusom DOB in virusom PUU povzročita različen odziv imunskih celic. Zanimalo nas je tudi, ali so prisotne razlike v limfocitnih populacijah povezane s potekom HMRS. Ugotovili smo, da imajo bolniki okuženi z virusom DOB statistično značilno večji delež celic NK, kot bolniki okuženi z virusom PUU. Prav tako smo potrdili večji delež celic NK pri bolnikih okuženih z virusom PUU, ki so imeli težji potek bolezni, kot pri bolnikih z blažjim potekom okužbe. Dodatno smo ugotovili, da imajo bolniki s težjim potekom okužbe z virusom PUU, višjo koncentracijo citotoksičnih celic NK CD56dim. Iz rezultatov sklepamo, da so celice NK povezane s težjim potekom HMRS. Še posebno so s težjim potekom okužbe z virusom PUU povezane citotoksične celice NK CD56dim. Z analizo limfocitov T smo ugotovili, da imajo bolniki okuženi z virusom PUU višjo koncentracijo limfocitov T kot bolniki okuženi z virusom DOB. Prav tako so rezultati pokazali višjo koncentracijo limfocitov T pri bolnikih okuženih z virusom PUU, ki so imeli blažji potek okužbe, kot pri bolnikih s težjim potekom bolezni. Dodatno smo z našo raziskavo ugotovili, da imajo bolniki okuženih z virusom PUU večjo koncentracijo celic Th ter več aktiviranih limfocitov T, ki izražajo aktivacijski marker CD69, ki se pojavi tik pred proliferacijo in aktivacijski marker HLA-DR, ki se pojavi tik pred klonsko ekspanzijo ter višjo koncentracijo aktiviranih efektorskih celic T (CD25+CD4+) in regulatornih celic T (CD4+CD25+CD127low/-), kot bolniki okuženi z virusom DOB. Iz rezultatov sklepamo, da višja koncentracija limfocitov T in večji specifični T celični odziv pripomoreta k blažjemu poteku HMRS po okužbi z virusom PUU, kot z virusom DOB. Bolniki okuženi z virusom DOB, ki so imeli blažji potek bolezni, so imeli večji delež celic Th, ki so izražale aktivacijski marker HLA-DR, kot bolniki z blažjim potekom okužbe z virusom DOB. Glede na rezultate menimo, da večji delež aktiviranih celic T pomagalk, pripomore k blažji obliki okužbe z virusom DOB. V tretjem delu doktorske naloge smo aktivacijo prirojenega imunskega odziva preverjali na nivoju koncentracije proteina visoko-mobilne skupine B1 (HMGB1). Želeli smo opredeliti vlogo HMGB1 kot napovednega dejavnika pri hantavirusni okužbi. Koncentracijo HMGB1 smo izmerili v supernatantih stimuliranih PBMC zdravih prostovoljcev ter v serumih bolnikov okuženih z virusom DOB in virusom PUU. Ugotovili smo, da je koncentracija HMGB1 višja v supernatantih stimuliranih PBMC z virusom DOB in virusom PUU, kot pri nestimuliranih PBMC, medtem ko razlika v koncentraciji HMGB1 med virusoma ni bila statistično značilna. Rezultate smo potrdili tudi z merjenjem koncentracije HMGB1 v serumih bolnikov s HMRS, pri čemer smo ugotovili, da imajo bolniki okuženi z virusom DOB in virusom PUU povišano koncentracijo HMGB1, med virusoma pa prav tako ni bilo statistično značilnih razlik. Z raziskavo smo prvi pokazali, da ima HMGB1 vlogo tudi v patogenezi HMRS. Pokazali smo, da je HMGB1 uporaben napovedni dejavnik za težji potek okužbe z virusom PUU, saj imajo bolniki s težjim potekom okužbe z virusom PUU višjo koncentracijo HMGB1, kot bolniki z blažjim potekom bolezni. Iz naše raziskave sklepamo, da je odziv prirojenega imunskega sistema bolj aktiviran po okužbi z virusom PUU, kot po okužbi z virusom DOB. Menimo, da zaviranje imunskega odziva gostitelja pripomore k težjemu poteku HMRS po okužbi z virusom DOB, kot po okužbi z virusom PUU. Našo ugotovitev smo v doktorski nalogi potrdili na treh nivojih. Na nivoju proučevanja IFN odziva smo ugotovili, da virus PUU bolj stimulira odziv IFN tipa I, višje izražanje gena MxA pripomore k lažjemu poteku okužbe z virusom PUU. Na nivoju proučevanja limfocitov smo potrdili, da virus PUU bolj aktivira specifični odziv limfocitov T, kot virus DOB. Na biološkem nivoju smo z merjenjem koncentracije beljakovine HMGB1 pokazali, da je HMGB1 vpleten v patogenezo HMRS in da je ustrezen napovedni dejavnik za težji potek bolezni po okužbi z virusom PUU. Zaviranje odziva IFN tipa I z virusom DOB je možen razlog, da HMGB1 ni ustrezen napovedni dejavnik za težji potek okužbe z virusom DOB.20182018-03-08 14:33:11Doktorsko delo/naloga100121VisID: 9291COBISS_ID: 294013184sl