Proteomska karakterizacija nanodelcev za ovrednotenje njihove citotoksičnosti in imunotoksičnosti ter razvoj novih vrst nanodelcevStrojan, Klemen (Avtor) Pavlin, Mojca (Mentor) Bregar , Vladimir B. (Komentor) nanodelciproteinska koronaimunotoksičnostNanodelci so delci zelo majhnih, nanometrskih dimenzij. Človek je lahko izpostavljen nanodelcem preko hrane, kozmetike in tekstila. Možna je tudi izpostavitev ob zdravljenju nekaterih specifičnih bolezni. Mehanizmi delovanja nanodelcev v organizmu še niso povsem jasni. Preden nanodelci pridejo v stik s celicami oziroma tkivi organizma so izpostavljeni medijem, ki vsebujejo makromolekule (proteine, lipide, nukleinske kisline). Odvisno od lastnosti makromolekul, nanodelcev in medija, med makromolekulami in površino nanodelcev potečejo interakcije, ki vodijo do nastanka t.i. biokorone. Biokorona je plast makromolekul, ki tvorijo interakcije s površino nanodelca, kadar pa govorimo o interakcijah med proteini in površino nanodelca, govorimo o proteinski koroni. Količine in tipe proteinov, ki so vezani na površino nanodelca, določajo fizikalno-kemijske lastnosti nanodelcev, lastnosti proteinov in lastnosti okoliškega medija. Osredotočili smo se na dva tipa magnetnih nanodelcev, relevantnih za biomedicinske aplikacije, ter na industrijsko proizvedene nanodelce, ki so prisotni v produktih za vsakdanjo rabo. V prvem delu disertacije smo pokazali, da je za interakcije med proteini in nanodelci bistvena predpriprava nanodelcev. Silicijeve nanodelce in kobalt feritne nanodelce, oplaščene s poliakrilno kislino, smo pred izpostavitvijo proteinom redčili v štirih različnih medijih ter dokazali, da izbira medija za predpripravo nanodelcev pomembno določa kvalitativno in kvantitativno sestavo proteinske korone. Nadalje smo preverili, če je spremenjena proteinska korona povezana z nastankom citokinov IL-6 in TNF-α v celični liniji THP-1. Povezave med spremenjeno proteinsko korono in izražanjem citokinov nismo dokazali, vendar pa lahko nanodelci vplivajo tudi na druge dele imunskega sistema. Citotoksičnost kobalt feritnih nanodelcev oplaščenih s polietileniminom smo želeli zmanjšati z dodatnim oplaščenjem z glutationom. Na celični liniji CHO smo pokazali, da lahko z glutationskim oplaščenjem dosežemo najmanj 30% višjo viabilnost v primerjavi z neoplaščeno formulacijo in zmanjšanje nastanka reaktivnih kisikovih zvrsti. Ključen korak je bil dodatek glutationa ob sintezi, saj z dodatkom prostega glutationa v celični medij ob hkratni izpostavitvi nanodelcem nismo dosegli želenega učinka. Primerjali smo tudi pot internalizacije neoplaščene in oplaščene formulacije, kjer nismo opazili razlik. Nanodelce smo našli izključno v znotrajceličnih veziklih, kar je v nasprotju s hipotezo lizosomalnega pobega. Dokazali smo, da so nanodelci kljub dodatnemu oplaščenju še vedno uporabni za transfekcijo, ki je glavna aplikacija omenjenih nanodelcev. Na celičnih modelih zdravega in rakastega urotelija smo dokazali selektivno endocitozo kobalt feritnih nanodelcev, oplaščenih s poliakrilno kislino, v rakaste celice urotelija. Na podlagi predpostavke o selektivni endocitozi in razumevanja citotoksičnosti kobalt feritnih nanodelcev oplaščenih s polietileniminom smo preverili potencialno obliko zdravljenja urotelijske papilarne neoplazme. Z dodatnim oplaščenjem citotoksičnih nanodelcev z govejim serumskim albuminom smo želeli zmanjšati poškodbe celične membrane, a hkrati ohraniti toksičnost, ki se izrazi po internalizaciji. Na tak način bi, ob predpostavki selektivne endocitoze, dosegli selektivno citotoksičnost proti rakastim celicam. Kratkotrajni učinek (merjenje viabilnosti po treh urah) je delno potrdil našo hipotezo, medtem ko dolgotrajni učinek (merjenje viabilnosti po štiriindvajsetih urah) ni bil v skladu s pričakovanimi rezultati. V predzadnjem delu disertacije je predstavljena kvantitativna analiza objavljene literature, ki združuje podatke o fizikalno-kemijskih lastnostih nanodelcev, sestavi proteinske korone in učinke na imunski sistem in vitro. Prva ugotovitev analize je bila, da je študij, ki združujejo vse tri kategorije podatkov, izredno malo, razlikovali so se tudi pogoji pod katerimi so bili posamezni eksperimenti izvedeni. Na podlagi 21 študij, ki so ustrezale našim kriterijem, smo naredili kvantitativno analizo. Primerjali smo dve skupini nanodelcev in sicer tiste, ki so sprožili povečan nastanek citokinov, proti ostalim. Pomembne razlike so bile med tipi nanodelcev v obeh skupinah, medtem ko razlik v hidrodinamskem premeru in zeta potencialu med skupinama nismo odkrili. Na podlagi našega vzorca smo sklenili, da sta sestava proteinske korone in sproščanje citokinov neodvisni spremenljivki. Ob koncu je predstavljena študija, s katero smo povezanost med lastnostmi nanodelcev, sestavo proteinske korone in sproščanjem citokinov preverili z lastnimi eksperimenti. Kljub temu, da smo lahko bistveno bolje kontrolirali pogoje posameznih meritev, nismo mogli podati trdnih zaključkov.20182018-02-07 07:15:01Doktorsko delo/naloga99599sl