Hitro določanje koncentracije infektivnih bakteriofagov lambdaUmek, Barbara (Avtor) Podgornik, Aleš (Mentor) biotehnologijabakteriofagimembranski proteiniizolacija proteinovfazni diagramiBakteriofag lambda je eden najbolj preučenih in uporabljenih virusov v mikrobni in molekularni genetiki. Koncentracijo lambde v vzorcu najpogosteje določamo z metodo plakov in čeprav je metoda delovno in časovno zahtevna, je možno le na tak način določiti koncentracijo infektivnih bakteriofagov. Znano je, da receptorski protein LamB bakterije S. sonnei sproži in vitro ejekcijo DNA bakteriofaga lambda, količina sproščene DNA pa sovpada s koncentracijo infektivnih bakteriofagov. Mehanizem in vitro ejekcije smo želeli uporabiti za izbrizganje DNA iz virusa ter postaviti metodo za hitro določanje koncentracije infektivnih bakteriofagov lambda, kjer spektrofotometrična analiza izločene DNA omogoča oceno števila bakteriofagov v izhodiščnem vzorcu. V ta namen smo potrebovali receptor LamB (maltoporin), ki smo ga izolirali iz bakterije E. coli LE392, saj spada v prvo biološko varnostno stopnjo in je senzitivnen organizem za bakteriofag lambda. Za test in vitro ejekcije smo uspešno pripravili ekstrakt membranskih proteinov, raztopljen v detergentu Triton X-100. Eksperimentalni podatki so pokazali, da receptor LamB ne sproži in vitro ejekcije DNA bakteriofaga, kar smo spremljali z metodo plakov. Ker je kombinacija detergentov in organskih topil v mešanici povzročila razslojevanje faz, smo se med faznimi stanji orientirali s trikotnim faznim diagramom ter spremenili razmerje reaktantov, tako da je ejekcija potekla v enofaznem območju. Rezultati eksperimenta ejekcije se niso spremenili, zato smo na tej točki zaključili z eksperimentalnim delom. Vzrok za neuspešno inaktivacijo virusa posredovano z LamB je lahko majhna a nezanemarljiva razlika med aminokislinskima zaporedjema receptorja LamB bakterij E. coli ter S. Sonnei, ki znaša 2 %.[B. Umek]20172017-12-24 07:16:30Magistrsko delo/naloga99155sl