VISOKOENERGIJSKA NAPRAVA ZA REVERZIBILNO IN IREVERZIBILNO ELEKTROPORACIJO CELIČNE MEMBRANEFLISAR, KAREL (Avtor) Miklavčič, Damijan (Mentor) Vončina, Danjel (Komentor) elektropermeabilizacijaireverzibilna elektroporacijaserijska vezava transistorjevpretočna komoraekstracija snovi iz celicinaktivacija mikroorganizmovvnos genskega materiala v celicoCelica, izpostavljena električnemu polju, spremeni svoje lastnosti, kar se kaže tudi v povečani prepustnosti celične membrane. Temu pojavu pravimo elektropermeabilizacija ali tudi elektroporacija. Ta pojav se uspešno uporablja v medicini, kjer povečana prepustnost membrane omogoči povečan vnos zdravil v celico in tako znatno poveča učinek zdravljenja. Takšno terapijo imenujemo elektrokemoterapija. Pojav elektropermeabilizacije se uporablja tudi za vnos genov v celico, pa tudi na ostalih področjih, kot so predelava hrane, uničevanje mikroorganizmov in v nekaterih biotehnoloških postopkih. Naprave, s katerimi dovajamo električne pulze, s katerimi zagotavljamo elektroporacijo membran, imenujemo elektroporatorji. Po namembnosti in uporabi jih razdelimo v dve skupini: v naprave za laboratorijsko in medicinsko uporabo ter naprave za industrijsko uporabo. Za prvo skupino naprav je značilno, da so praviloma namenjene dovajanju omejenega števila pulzov. Druga skupina naprav je namenjena neprekinjenemu (trajnemu) delovanju in od prej omenjene skupine (laboratorijskih in medicinskih naprav) odstopa predvsem po večji moči in maksimalnih amplitudah napetosti, vendar pa imajo običajno skromne možnosti spreminjanja ostalih parametrov elektroporacije (širina pulza, oblika pulza, ponavljalna frekvenca pulza). Med skupino laboratorijskih naprav in skupino industrijskih naprav obstaja vrzel: na trgu namreč ni na voljo naprav, ki bi združevale nekatere lastnosti (npr. fleksibilnost, kompaktnost/prenosljivost) laboratorijskih naprav in energetsko zmogljivost industrijskih naprav. Načrtovanje in gradnja industrijskih naprav sta uspešni, če se prej opravijo številni poskusi v laboratorijskem okolju. Včasih je potrebno ponoviti nekatere poskuse tudi v industrijskem okolju. Zato je ena od zelo pomembnih lastnosti naprave, ki bi jo lahko uporabljali v obeh okoljih, njena mobilnost, kar poenostavljeno pomeni, da jo lahko premeščamo brez posebnih pomagal. Druga pomembna lastnost takšne naprave je zmožnost neprekinjenega delovanja in doseganje električnih parametrov v širokem razponu parametrov pulzov in tudi aplikacij, ki omogočijo tudi ireverzibilno elektroporacijo, to je postopek, pri katerem celica zaradi visokega električnega polja in vnosa energije odmre. Fleksibilnost, prenosljivost in možnost neprekinjenega delovanja so bile osnovne smernice, ki so nas vodile pri načrtovanju laboratorijske naprave za neprekinjeno delovanje. Na podlagi temeljite analize smo se odločili za razvoj naprave, ki bo omogočila dovajanje pulzov pravokotne oblike v območju: napetosti od 0 do 5000 V, pulzov od 10 μs do 10 ms in ponavljalne frekvence do 100 Hz, in ki bo torej omogočalo natančno analizo povezave med učinki elektroporacije in uporabljenimi parametri, kot so napetost, tok in vnešena energija. Med možnimi tehničnimi variantami generiranja visokonapetostnih pulzov smo se odločili za generiranje pulzov s visokonapetostnim stikalom, ki je realizirano s serijsko vezavo transistorjev. Ta izvedba omogoča tudi (skoraj) poljubno nadgradnjo v smeri višjih izhodnih napetosti ob uporabi na trgu dostopnih in relativno poceni komponent. Ker je stikalo krmiljeno z optičnimi vlakni, je to tudi pomemben nastavek v smeri gradnje industrijske naprave. Drugi ključni del naprave je vir visoke napetosti, ki je bil v preizkusnem obdobju realiziran z uporabo nastavljivega transformatorja (variaka) in visokonapetostnega ločilnega transformatorja. Verjetno je največ težav in ovir pri gradnji ter preizkušanju naprave povzročila pomanjkljiva izbira materiala in komponent, primernih za uporabo v visokonapetostnem okolju, in pomanjkanje izkušenj, kar pa smo v letih razvoja naprave uspešno prebrodili. V okviru naloge sem zgradil dve napravi: napravo PBp in napravo Bruno. V slednji smo uporabili vse izkušnje, ki smo jih pridobili pri gradnji in uporabi prve naprave. Z napravama smo naredili več kot 1500 poskusov v laboratorijskem in polindustrijskem okolju na področjih, kot so: inaktivacija mikroorganizmov, ekstrakcija snovi iz celic, vnos genskega materiala v celice in poskusov priprave materialov za industrijske procese (impregnacija lesa). Pri poskusih s pretočnimi sistemi smo uporabljali pretočne komore, izdelal jih je dr. G. Pataro na Univerzi v Salernu, vendar smo se na podlagi izkušenj lotili razvoja in izdelave lastnih komor. Z novo konstrukcijo bomo zmanjšali korozijo elektrod, dosegli boljše tesnjenje komore in možnost izpostavitve vzorcev/celic večjemu električnemu polju.20172017-10-16 11:30:08Doktorsko delo/naloga96788sl