Priprava in preverjanje aktivnosti delecijske mutante gena naravne imunosti Nlrp3 s tehnologijo CRISPR/Cas9.Brvar, Luka (Avtor) Horvat, Simon (Mentor) Hafner Bratkovič, Iva (Komentor) NLRP3CRISPR/Cas9spreminjanje genovmakrofagiNLRP3 je protein, ki lahko tvori inflamasom. Inflamasomi so znotrajcelični multimerni proteinski kompleksi in vodijo obrambo proti molekulskim vzorcem povezanimi s patogeni in poškodbami. NLRP3 tudi klinično zanimiv, saj sodeluje pri nastanku in napredovanju avtoinflamatornih in avtoimununskih bolezni. Namen naloge je bil spremeniti gen Nlrp3 v celicah mišjih makrofagov s tehnologijo CRISPR/Cas9 in preveriti delovanje mutante pod endogenim promotorjem. Tehnologija CRISPR/Cas9 je nedavno razvita tehnologija, ki omogoča tarčno spreminjanje genoma. Pripravili smo mestno specifične konstrukte, ki bi lahko tarčno rezali zaporedje DNA in bi posledično vnesli stop kodon ali spremenili bralni okvir gena Nlrp3 s čimer bi odstranili domeno LRR iz zrelega proteina NLRP3. Delovanje konstruktov smo preverili s testom T7, test s plazmidom pCAG-EGxxFP in cepitvijo in vitro. Nato smo s konstruktom elektroporirali celice mišjih makrofagov, jih ločili s celičnim ločevalcem in pripravili posamezne klone. S prenosom po westernu smo preverili večje število klonov. Prisotnost mutacij smo nadaljnje preverili s testom T7, za aktivacijo inflamasoma in zorenje IL-1β pa smo uporabili imunoencimski test ELISA. V nalogi nam ni uspelo pridobiti delecijske mutante NLRP3, s katero bi lahko preverjali lastnosti proteina NLRP3, smo pa prikazali potek dela za dizajniranje, pripravo in uporabo tehnologije CRISPR/Cas9 za preverjanje molekularnega mehanizma aktivacije inflamasoma NLRP3. Aktivacija inflamasoma NLRP3 je povezana z vnetnimi boleznimi, tako, da je znanje o mehanizmih potrebnih za izgradnjo inflamasoma NLRP3 zelo pomembno za dizajniranje novih načinov zdravljenja.[L. Brvar]20172017-10-02 15:55:30Magistrsko delo/naloga96455sl