Priprava mutant amoditoksina A za ultrastrukturno lokalizacijo v mitohondrijuIvanušec, Adrijan (Avtor) Križaj, Igor (Mentor) fosfolipazesPLA2amoditoksin&#946-nevrotoksičnostproteinsko inženirstvoAmoditoksin A (AtxA) je sekretorna fosfolipaza A2 (sPLA2) iz modrasovega strupa, ki ima močan presinaptično nevrotoksični ali β-nevrotoksični učinek. Delovanje AtxA na molekulskem nivoju še ni v celoti pojasnjeno. Učinki tega toksina, med drugimi, vključujejo tudi nabrekanje nevronskih mitohondrijev in porušenje njihove notranje strukture. Ob tem ostaja nejasno, na kakšen način je v molekulski mehanizem nevrotoksičnosti AtxA vpletena encimska aktivnost toksina in ali je le-ta potrebna za njegov vstop v mitohondrij. V magistrskem delu smo uspešno pripravili molekularno-biološka orodja za preučevanje vloge encimske aktivnosti AtxA v molekulskem mehanizmu nevrotoksičnosti. S pomočjo mestno-specifične mutageneze, izražanja v E. coli in in vitro renaturacije smo pripravili rekombinantne proteine, AtxA(dt) (AtxA(dt)), AtxA(D49S) in AtxA(D49S/N79C), jih temeljito okarakterizirali in potrdili, da imajo pravilno molekulsko maso in aminokislinsko zaporedje na N-koncu ter so pravilno zviti. Preverili smo jim tudi encimsko aktivnost in, v skladu s predvidevanji, ugotovili, da mutanta AtxA(D49S) in AtxA(D49S/N79C) nista bila encimsko aktivna, AtxA(dt) pa je imel fosfolipazno aktivnost. Prav tako smo potrdili predvidevanje, da mutaciji ne bosta bistveno vplivali na interakcijo rekombinantnih proteinov z Atx-vezavnim proteinom kalmodulinom (CaM).20172017-09-21 07:53:10Magistrsko delo/naloga95634sl