ELEKTROPORACIJA KOT NARAVNI MEHANIZEM HORIZONTALNEGA PRENOSA GENOV PRI PROKARIOTIHMARJANOVIČ, IGOR (Avtor) Kotnik, Tadej (Mentor) Elektroporacijahorizontalni prenos genovstreleevolucijaprokariotiVeč vej znanosti si še vedno prizadeva ugotoviti, kako je življenje nastalo. Čeprav so si teorije nastanka življenja na Zemlji v podrobnostih lahko močno različne, so si v grobem enotne, da se živa bitja skozi naravno selekcijo prilagajajo okolju, v katerem se nahajajo. Temu procesu prilagajanja skozi čas pa pravimo evolucija. Vemo, da so bila enocelična bitja prisotna pred večceličnimi, celice brez jedra (prokarioti) pa pred celicami z jedrom (evkarioti). Do devetdesetih let prejšnjega stoletja je veljalo tudi prepričanje, da so bile najpomembnejši vir inovacij v evoluciji mutacije, ki so se z delitvijo celice (vertikalnim prenosom genov) prenašale na njene potomke. Ta teorija se je porušila, ko so znanstveniki pričeli sorodnost organizmov vrednotiti glede na sorodnost njihovih genomov (temu postopku pravimo filogenetska analiza) in pri tem ugotovili, da pri sledenju sorodnosti različnih genov pridejo do različnih sorodnostnih struktur (filogenetskih dreves). Študije genomov so pokazale tudi, da nekateri organizmi vsebujejo gen, ki ga njihovi bližji sorodniki nimajo, najdemo pa ga (enakega ali zelo podobnega) pri nekaterih evolucijsko zelo oddaljenih organizmih. Iz teh ugotovitev izhaja, da organizmi v splošnem prevzemajo gene ne le od celice, iz katere izvirajo, temveč tudi iz okolice oziroma od drugih organizmov. Ta proces imenujemo horizontalni prenos genov (HGT). Rezultati filogenetskih študij kažejo, da je bil HGT skozi evolucijo in je še danes pomemben vir inovacij, ki so omogočile hitrejši in bolj raznolik razvoj zgodnjega življenja. V znanstveni literaturi zasledimo tri mehanizme HGT: naravno kompetenco, konjugacijo in transdukcijo. Vsi našteti mehanizmi so biološki in temeljijo na proteinih z ozko specifičnim delovanjem, iz česar sledi, da so tudi sami nastali šele v določeni fazi evolucije, zato se zastavlja vprašanje, ali za HGT obstaja tudi kak preprostejši, denimo povsem fizikalen mehanizem, ki je lahko deloval že vse od nastanka življenja. Eden najobetavnejših tovrstnih mehanizmov je elektroporacija. Elektroporacija je pojav, ki omogoča vnos tujega materiala tako v prokariotske kot v evkariotske celice. Kot laboratorijska metoda je bila razvita pred štirimi desetletji, temelji pa na kratkotrajni izpostavitvi celice električnemu polju dovolj visoke jakosti, ki ga običajno ustvarimo z dovajanjem napetostnih pulzov na par elektrod, med katerima se nahajajo celice. Posledica izpostavitve celice takšnim pulzom je povečanje prepustnosti celične membrane, ki omogoči vnos najrazličnejših snovi, tudi DNA, iz okolice v celico, lahko pa tudi iztekanje snovi iz celice. Če iztekanje ni premočno in celica po končani izpostavitvi pulzom preživi, govorimo o reverzibilni, sicer pa o ireverzibilni elektroporaciji. V naravi se ob udaru nevihtne strele v habitat prokariotskih organizmov v bližini točke udara ustvari električno polje, zadostno za povzročitev elektroporacije – zelo blizu točke udara so prisotni pogoji za ireverzibilno elektroporacijo in s tem iztekanje DNA, nekoliko dlje od te točke pa pogoji za reverzibilno elektroporacijo in s tem vnos DNA. Za preučevanje elektroporacije kot naravnega mehanizma HGT je potrebno opraviti biološke poskuse, kjer se v kontroliranih laboratorijskih pogojih čim bolj približamo naravnim razmeram ob udaru strele. V ta namen je bilo potrebno razviti napravo, ki nam take poskuse omogoča. Po razčlenitvi zgoraj opisanih spoznanj in motivacije te disertacije sledi opis načrtovanja, izdelave in testiranja modularnega sistema za izpostavitev emulacijam električne strele (sistem »Znanstveni Emulator eVolucijskih Strel« – ZEVS) in pripadajočega visokonapetostnega generatorja (generator ZEVS). Sistem ZEVS nam omogoča, da biološke vzorce (celice ali tkiva) v kontroliranem okolju (točno določena dolžina obloka razelektritve, merjenje časovnega poteka električnega toka, ki teče skozi vzorec, snemanje poteka poskusov s hitro kamero) izpostavimo elektrostatični razelektritvi z nastavljivo amplitudo električnega toka (do nekaj sto amperov). To predstavlja ponovljivo emulacijo elektrostatične razelektritve, kakršna poteka pri naravni streli. Ta sistem raziskovalcem omogoča, da uporabijo poljubni generator elektrostatičnih razelektritev z ustrezno ozemljitveno elektrodo in prilagodljivo dolžino obloka. Modularna zasnova sistema omogoča hitro montažo in demontažo, kot tudi preprosto in temeljito čiščenje. Pri razvoju sistema smo si pomagali z računalniškim modeliranjem, kjer smo pred izdelavo prvega prototipa načrtovali vse komponente, virtualno sestavili sistem in njegove dimenzije iterativno določili z numeričnimi izračuni porazdelitve električnega toka in jakosti električnega polja, temelječimi na metodi končnih elementov. Sistem smo zasnovali tako, da se ga da hitro sestaviti in razstaviti, kar omogoča preprosto transportiranje in izvajanje poskusov v različnih laboratorijih. Pozorni smo bili tudi na to, da je mogoče sistem enostavno in temeljito očistiti, kar bistveno zmanjša tveganje kontaminacije, hkrati pa omogoča ponovljivost poskusov. Pri izbiri materiala smo za dele, ki zahtevajo električno neprevodnost, uporabili polietilen, kjer je bila poleg neprevodnosti sestavnega dela potrebna tudi njegova prozornost, pa pleksi steklo. Elektrode smo prvotno izdelali iz bakra, a se je izkazalo, da razelektritve povzročajo njihovo korozijo, zato smo baker v nadaljevanju razvoja nadomestili z nerjavečim jeklom, ki se je izkazalo za ustrezno odporno proti razelektritveni koroziji. Pri ozemljitveni elektrodi, ki je v neposrednim stikom z biološkim vzorcem, pa je nerjaveče jeklo ustreznejše tudi zato, ker se v primerjavi z bakrom precej manj elektrolitsko raztaplja in tako manj kontaminira vzorec. V prvih serijah preizkusov sistema ZEVS smo kot generator razelektritev uporabili komercialni električni paralizator (taser), ki je generiral razelektritveni tok s trajanjem nekaj sto nanosekund, nato pa smo načrtovali in zgradili visokonapetostni električni generator, ki temelji na krmiljeni 5 kV razelektritvi kondenzatorja s kapacitivnostjo 1 μF (generator ZEVS) in je po časovnem poteku generiranega razelektritvenega toka precej bolj podoben dejanskim nevihtnim strelam (dvig toka z ničle do maksimuma v približno 5 μs, nato pa eksponentno upadanje s časovno konstanto približno 75 μs). Prve biološke poskuse smo opravili na bakterijah Escherichia coli, nasajenih na agarju v petrijevkah z notranjim premerom 86 mm, razelektritve pa smo generirali z električnim paralizatorjem. Petrijevke z agarjem in nasajenimi bakterijami smo vstavili v sistem ZEVS in preko konične elektrode v središče petrijevke dovedli 10 zaporednih razelektritev. Tok vsake razelektritve je imel največjo vrednost pri ~100 A, dvižni čas od nič do največje vrednosti ~0.1 μs in čas upada do polovične vrednosti ~0.3 μs. Dolžina obloka pri vsaki razelektritvi je bila ~15 mm. Pri poskusih smo v krožnem področju do radija 5 mm od središča petrijevke dobili območje skoraj popolnoma brez kolonij E. coli. Izračunana jakost električnega polja na tej radialni razdalji je bila ~8 kV/cm. Opisani eksperimentalni rezultati in izračuni skupaj povedo, da je bilo osrednje območje brez živih bakterij zaradi njihove ireverzibilne elektroporacije. Drug sklop bioloških poskusov smo opravili na ovarijskih celicah kitajskega hrčka (celicah CHO), ki so evkariotske. Tudi pri teh poskusih smo za generator razelektritev še uporabljali električni paralizator. Celice CHO smo nasadili v petrijevke z notranjim premerom 52 mm. Preden smo petrijevke izpostavili razelektritvam, smo iz njih odstranili gojišče in nato dodali 1.5 ml svežega gojišča, ki je vsebovalo 4 μg/ml plazmidne DNA pEGFP‐N1, z izražanjem katere nastaja zeleno fluorescirajoči protein (GFP). Nato smo petrijevke zaporedoma vstavljali v sistem ZEVS in vsaki dovedli 10 elektrostatičnih razelektritev. Električni tok vsake razelektritve je imel največjo vrednost pri ~14 A, dvižni čas od nič do največje vrednosti ~0.5 μs in čas upada do polovične vrednosti ~1.5 μs. Dolžina obloka pri vsaki razelektritvi je bila ~7 mm. V krožnem pasu na razdalji od 3 do 15 mm od središča petrijevke smo zaznali fluorescenco GFP, ki je odražala vnos in izražanje pEGFP‐N1, torej je bilo to območje reverzibilne elektroporacije. Z izračunom smo ocenili jakost električnega polja 15 mm od središča petrijevke na 1.11 kV/cm, 3 mm od središča pa na 5.54 kV/cm, kar nakazuje, da so bile celice v osrednjem območju, kjer nismo zaznali fluorescence GFP, mrtve zaradi ireverzibilne elektroporacije, v zunanjem območju, kjer prav tako ni bilo zaznavne fluorescence GFP, pa niso bile elektroporirane, zato ni prišlo do vnosa DNA. Tretji sklop poskusov pa je bila ireverzibilna elektroporacija spor bakterije Bacillus pumilus, nasajenih na agarju v petrijevkah, pri teh poskusih pa smo kot napetostni generator uporabili tako električni paralizator kot generator ZEVS, ki smo ga takrat že razvili. Z obema generatorjema smo dosegli ponovljivo inaktivacijo spor. Pri poskusih s paralizatorjem smo z 20 razelektritvami dobili inaktivacijo na 0.65% celotne petrijevke, medtem ko je območje inakativacije pri uporabi generatorja ZEVS pokrivalo 7% celotne petrijevke pri eni razelektritvi, 27% pri desetih in 55% pri petdesetih razelektritvah. Opravljeni poskusi so pokazali, da je sistem ZEVS primeren za preučevanje vplivov elektrostatičnih razelektritev na prokariotske in evkariotske celice ter da z njim lahko povzročimo tako ireverzibilno elektroporacijo, katere posledica je lahko tudi iztekanje DNA, kot reverzibilno elektroporacijo, ki privede do vnosa DNA in njeno izražanje. Poskusa ireverzibilne elektroporacije na celicah E. coli in genske transfekcije na celicah CHO nakazujeta, da bi bila elektroporacija dejansko lahko četrti mehanizem prenosa HGT v naravi, vendar pa bo za zanesljivejši in kvantitativno relevanten odgovor potrebno s sistemom ZEVS opraviti dodatne poskuse na organizmih, katerih naravno okolje je dosegljivo nevihtnim strelam (denimo na bakterijah, ki naseljujejo površinske morske in sladke vode). Poleg tega pa bo potrebno namesto modelnih laboratorijskih molekul DNA, kot so tiste z genom za GFP ali odpornostjo na antibiotike, uporabiti naravno DNA brez modifikacij, s katerimi umetno povečamo njihovo stabilnost ter verjetnost vnosa in izražanja.20152015-03-26 13:00:04Doktorsko delo/naloga30673sl