Funkcijska transkriptomika in kvantifikacija biofilma bakterij Campylobacter jejuniVolk, Manca (Avtor) Klančnik, Anja (Mentor) Campylobacter jejunibiofilmienovrstni biofilmivečvrstni biofilmikvantifikacijaPMA-ddPCRsekvenciranje RNAdiferenčno izraženi geniBiofilmi bakterij Campylobacter jejuni pomembno prispevajo k njihovemu preživetju v okoljih zunaj gostitelja ter hkrati otežujejo zanesljivo kvantifikacijo živih celic, molekularni mehanizmi, vključeni v nastanek in razvoj biofilma, pa še niso v celoti pojasnjeni. Namen doktorske disertacije je bil vpeljati metodo PMA v kombinaciji z digitalnim PCR (ddPCR) za kvantifikacijo bakterij C. jejuni v enovrstnih in večvrstnih biofilmih ter preučiti molekularne in fiziološke mehanizme, vključene v razvoj biofilma. Metodo PMA-ddPCR smo vpeljali in ovrednotili za kvantifikacijo bakterij C. jejuni v enovrstnih in večvrstnih biofilmih. Ugotovili smo, da je dvakratno tretiranje z reagentom PMA učinkoviteje zmanjšalo signal DNA iz mrtvih celic kot enkratno tretiranje, vendar popolnega utišanja signala ni omogočilo. Z uporabo sekvenciranja RNA smo analizirali izražanje genov bakterij C. jejuni med razvojem enovrstnih in večvrstnih biofilmov ter ugotovili, da biofilmski način rasti spremljajo usklajene metabolne in strukturne prilagoditve. Razvoj enovrstnega biofilma je bil povezan s povišanim izražanjem genov, vključenih v biosintezo aminokislin, odziv na oksidativni stres in nastanek bičkov, hkrati pa z znižanim izražanjem genov, povezanih z energijskem metabolizmom in transportom. V zrelih fazah biofilma se je dodatno znižalo izražanje genov, vključenih v biosintezo kapsularnih polisaharidov in lipooligosaharidov. V večvrstnih biofilmih ob prisotnosti bakterij Pseudomonas fragi so bakterije C. jejuni izkazale izrazitejši in širši transkripcijski odziv, ki je odražal kompetitivne interakcije v biofilmu. Odziv je vključeval obsežno preoblikovanje površinskih struktur, časovno odvisne spremembe v odzivih na stres in energijskem metabolizmu ter aktivacijo obrambnih mehanizmov. Na podlagi rezultatov sekvenciranja smo izbrali gene Cj0735, Cj0736 in Cj1465 ter pripravili ustrezne mutante. Fenotipska analiza mutantov je pokazala spremembe v agregaciji in gibljivosti, lastnostih, ki sta povezani z nastankom in razvojem biofilma bakterij C. jejuni.[M. Volk]20262026-10-24 07:15:16Doktorsko delo/naloga190192sl