Identifikacija optimalne kombinacije referenčnih genov v primarnih človeških perinatalnih mezenhimskih matičnih/stromalnih celicah za kvantitativno verižno reakcijo s polimerazoSuša, Hana (Avtor) Zupan, Janja (Mentor) Trojner Bregar, Andreja (Komentor) perinatalne mezenhimske matične/ stromalne celice (MSC)referenčni geninormalizacija izražanja genovkvantitativna verižna reakcija s polimerazo v realnem času (qPCR)stabilnost izražanja genovPerinatalna tkiva so dostopen vir mezenhimskih matičnih/stromalnih celic (MSC) z velikim raziskovalnim in terapevtskim potencialom. Za zanesljivo vrednotenje izražanja genov v teh celicah je potrebna ustrezna normalizacija rezultatov. Ta temelji na uporabi referenčnih genov, katerih izražanje mora biti v proučevanih celicah in izbranih eksperimentalnih pogojih čim bolj stabilno. Namen magistrskega dela je bil med šestimi kandidatnimi referenčnimi geni določiti najprimernejšo kombinacijo za normalizacijo izražanja genov v nediferenciranih primarnih humanih MSC iz posteljice (PL) in amnijske membrane (AM). Celokupno ribonukleinsko kislino (RNA) smo izolirali iz šestnajstih vzorcev, pridobljenih od dvanajstih preiskovank, ter določili njeno koncentracijo in čistost. En vzorec smo zaradi prenizke koncentracije RNA izključili iz nadaljnje analize. Izražanje kandidatnih referenčnih genov smo določili s kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo v realnem času (qPCR). Zanesljivost meritev smo ovrednotili na podlagi učinkovitosti in specifičnosti pomnoževanja ter ponovljivosti tehničnih ponovitev, stabilnost izražanja pa z algoritmom geNorm. Izražanje vseh šestih kandidatnih genov je bilo merljivo in dobro ponovljivo. Pet genov je izkazalo ustrezno učinkovitost pomnoževanja, medtem ko je ta pri genu za beta-glukuronidazo (GUSB) znašala 80,3 odstotka, zaradi česar ga nismo vključili v nadaljnjo analizo stabilnosti izražanja kandidatnih referenčnih genov. Kot najstabilnejša se je izkazala kombinacija gena za gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazo (GAPDH) in gena za beta-aktin (ACTB). Analiza parne variacije je pokazala, da za zanesljivo normalizacijo zadoščata dva referenčna gena. Na podlagi rezultatov lahko sklenemo, da je par GAPDH–ACTB najprimernejša kombinacija med petimi geni, vključenimi v končno analizo, in za skupno analizirani nabor 15 vzorcev PL- in AM-MSC. O stabilnosti izražanja GUSB na podlagi te analize ne moremo sklepati, pred njegovo morebitno ponovno vključitvijo pa bi bilo treba optimizirati qPCR test. Izbrani par bi bilo treba pred rutinsko uporabo potrditi na večjem in neodvisnem naboru vzorcev.[H. Suša]20262026-10-01 08:45:49Magistrsko delo/naloga189073sl