Odkrivanje novih zaviralcev galaktoziltransferaz in njihovo biološko vrednotenje in vitroKranjc, Jaka (Avtor) Pišlar, Anja (Mentor) Anderluh, Marko (Komentor) bioprocescelice ovarija kitajskega hrčkagalaktoziltransferazaglikozilacijazaviralciSelektivno uravnavanje glikozilacije je ključnega pomena pri razvoju in proizvodnji terapevtskih glikoproteinov, saj glikanske strukture pomembno vplivajo na stabilnost proteinov, njihovo učinkovitost, imunogenost in farmakokinetične lastnosti. Modulacija N-vezane galaktozilacije se je uveljavila zlasti kot obetavna strategija za glikoinženirstvo rekombinantnih protiteles in drugih biofarmacevtskih izdelkov. Selektivno uravnavanje N-vezane galaktozilacije ostaja izziv pri proizvodnji terapevtskih glikoproteinov. V tej doktorski disertaciji smo preučevali modulacijo galaktozilacije z majhnimi molekulami s ciljanim zaviranjem β-1,4-galaktoziltransferaze 1, ključnega encima, ki katalizira prenos galaktoze med zorenjem Nglikanov. Raziskavo smo začeli z virtualnim rešetanjem na osnovi strukture, ki je temeljilo na kristalografski strukturi β-1,4-galaktoziltransferaze 1. Filtrirali smo obsežne knjižnice komercialno dostopnih spojin glede na učinkovinam podobne fizikalno-kemijske lastnosti, generirali več konformacij ligandov in spojine z molekularnim sidranjem umestili v UDP-vezavno mesto encima β-1,4-galaktoziltransferaze 1. S slednjim smo pridobili nabor najbolje uvrščenih kandidatnih spojin na podlagi predvidenih vezavnih načinov, kemijske raznolikosti in komercialne dostopnosti. Izbrane spojine smo nato eksperimentalno ovrednotili z uporabo luminiscenčnega testa na osnovi UDP za kvantifikacijo zaviranja encimske aktivnosti in vitro. S tem pristopom smo identificirali več mikromolarnih zaviralcev izoliranega encima, potrdili ustreznost računalniškega presejalnega pristopa in razkrili nove kemotipe zaviralcev brez strukturnih motivov, značilnih za ogljikove hidrate. Nadaljnji poskusi odvisnosti učinka zaviralcev od koncentracije so omogočili neposredno primerjavo inhibitorne moči med najbolj obetavnimi spojinami. Za določitev biološke relevantnosti smo te zaviralce testirali v sesalskih celičnih kulturah, ki proizvajajo rekombinantna protitelesa IgG. Šaržna gojenja celic z dohranjevanjem v globokih mikrotitrskih ploščah in majhnih mešanih bioreaktorjih so omogočila sistematično oceno rasti celic, viabilnosti, produktivnosti in N-glikanskih profilov protiteles po dodatku izbranih zaviralcev. Več zaviralcev je v odvisnosti od koncentracije zmanjšalo galaktozilacijo brez negativnega vpliva na bioprocesne lastnosti. Vendar celični izidi niso dosledno sledili učinkom na izoliranem encimu, saj je en zaviralec povečal galaktozilacijo kljub močnem, tarčno usmerjenem zaviranju in vitro. Za razlago teh neskladij smo kvantificirali znotrajcelične koncentracije spojin z uporabo tekočinske kromatografije, sklopljene z dvojno masno spektrometrijo, po časovno ločeni lizi celic. Te meritve so razkrile izrazite razlike v celični permeaciji ter pokazale, da neposredno znotrajcelično zaviranje samo po sebi ne more pojasniti opaženih sprememb galaktozilacije. Podatki zato podpirajo prispevek posrednih, membransko povezanih ali presnovno odvisnih mehanizmov k modulaciji glikozilacije. Doktorska disertacija prikazuje tako potencial kot omejitve neposrednega zaviranja galaktoziltransferaz in vzpostavlja integriran raziskovalni okvir, ki povezuje računalniško načrtovanje z bioprocesno relevantnim vrednotenjem v celičnih kulturah. Ugotovitve predstavljajo osnovo za racionalni razvoj naslednje generacije strategij glikoinženirstva in prispevajo k poglobljenemu razumevanju kompleksnih mehanizmov, ki uravnavajo glikozilacijo terapevtskih proteinov.[J. Kranjc]20262026-09-26 07:15:16Doktorsko delo/naloga188690sl