Optimizacija šaržne reakcije transkripcije in vitro s kotranskripcijskim pokritjem 5’-konca mRNAJordan Ferbežar, Uma (Avtor) Gunčar, Gregor (Mentor) mRNAIVTDOEoptimizacija5’‑kapaMolekula informacijske RNA (mRNA, angl. messenger RNA) igra vlogo povezovalca med gensko informacijo, shranjeno v molekuli DNA, in proteini, za katere ta informacija zapisuje. Zaradi svojega prehodnega izražanja in nezmožnosti vključitve v gostiteljski genom je mRNA privlačna za uporabo v različne terapevtske namene, na primer kot cepivo, protirakava imunoterapija ali sredstvo celičnega reprogramiranja. Molekule mRNA sintetično proizvajamo s postopkom reakcije transkripcije in vitro (IVT, angl. in vitro transcription), ki je zaradi kompleksne narave in visokih stroškov primerna za optimizacijo s pristopom načrtovanja eksperimentov (DOE, angl. design of experiments). Pri diplomskem delu smo želeli reakcijo optimizirati tako, da bi z zmanjšanjem količine uporabljenega reagenta za kotranskripcijsko pokritje 5’‑konca mRNA CleanCap AG povečali stroškovno učinkovitost reakcije, obenem pa ohranili visok delež ustrezno pokritega produkta in omejili nastanek imunogenega stranskega produkta, dvoverižne RNA (dsRNA, angl. double‑stranded RNA). Pokritje 5’-konca mRNA s kapo je ključnega pomena za kakovost in varnost mRNA terapevtika, zato smo želeli doseči učinkovitost pokritosti s 5’-kapo vsaj 95 %. Za namen optimizacije smo izvedli 20 šaržnih reakcij IVT, v katerih smo proizvedli mRNA z zapisom za ojačani zeleni fluorescenčni protein (eGFP, angl. enhanced green fluorescent protein) in s pomočjo programa za načrtovanje eksperimentov MODDE preučili vpliv različnih parametrov na potek reakcije. Ugotovili smo, da lahko najboljše rezultate dosežemo z nizkim razmerjem med koncentracijo Mg2+ in koncentracijo NTP, ki nam omogoči manjšo porabo reagenta CleanCap AG ob visoki učinkovitosti pokritosti, obenem pa zmanjša vsebnost dsRNA in ne poslabša donosa reakcije. Določili smo tudi optimalno točko reakcije in jo uspešno validirali na konstruktu mRNA z zapisom za eGFP, delno pa tudi na konstruktih z zapisom za luciferazo in za protein bodice virusa SARS‑CoV‑2. Glede na količino pridobljene mRNA smo dosegli zmanjšanje porabe reagenta CleanCap AG za 25 % v primerjavi z originalnim protokolom proizvajalca reagenta.20262026-09-23 10:10:03Diplomsko delo/naloga188475sl