Proučevanje škodljivih učinkov policikličnih aromatskih ogljikovodikov v onesnaženem zraku na in vitro humanih celičnih modelih z uporabo mikroskopskih tehnikRežonja, Blaž (Avtor) Štern, Alja (Mentor) Štampar, Martina (Komentor) HepG2sferoidiin vitro 3DD celični modelksenobiotikigenotoksičnostoksidativni strespoliciklični aromatski ogljikovodikiavtomatska mikroskopija HTSkvantitativna analiza slikemultivariatne statistične metoderazvoj delovnega postopkaOnesnaženost zraka je eden od vodilnih dejavnikov tveganja za javno zdravje. Med pomembnejša onesnažila spadajo policiklični aromatski ogljikovodiki (PAH), ki pa so kot obsežna družina sorodnih spojin relativno slabo toksikološko opredeljeni. V namen celostne identifikacije njihove škodljivosti smo razvili delovni postopek avtomatizirane visokopretočne fluorescenčne mikroskopije in kvantitativne analize slik. S pristopom smo na celični liniji HepG2 proučevali potencialno genotoksičnost (PARP1, γH2AX, pH3), odziv na poškodbe DNK (Gadd45α, p21, Ki67) in indukcijo oksidativnega stresa (8-OxoG, Hmox1, SRXN1). Metodološki pristop smo potrdili v 2D kulturi z uporabo modelnih kemikalij z znanim mehanizmom delovanja (etopozid, kolhicin, KBrO3) in benzo[a]pirena (BAP) kot referenčnega PAH-a ter potrdili visoko zanesljivost in primerljivost kvantifikacije med komercialno opremo (Agilent BioTek Gen5) in uveljavljenim programom FIJI/ImageJ. Avtomatska kvantifikacija je dosegla visoko korelacijo z ročno analizo brez sistemske pristranskosti, pri čemer je bila pretočnost analize med 2D vzorci in parafinskimi rezinami sferoidov primerljiva. V drugem delu smo z razvitim postopkom ocenili toksikološki profil manj raziskanih PAH-ov – benzo[b]fluorantena (BBF), benzo[ghi]perilena (BGP) in njune binarne mešanice – ter primerjali odzive med standardnim 2D modelom in naprednim 3DD celičnim modelom (zreli sferoidi HepG2, gojeni 21 dni pod dinamičnimi pogoji). Podatke smo analizirali z linearnimi (mešanimi) modeli in multivariatnimi pristopi (PERMANOVA, PCA) v programu RStudio. Rezultati so pokazali, da BBF izkazuje izrazito genotoksičnost primerljivo z BAP, saj povzroča dvoverižne prelome DNK (γH2AX) in aktivira odziv na poškodbe DNK (p21). BGP se je izkazal za manj genotoksičnega, vendar pri višjih koncentracijah primarno sproža oksidativni stres (Hmox1, SRXN1). V 3D celičnem modelu so se celični odzivi na vse testirane ksenobiotike znatno spremenili in okrepili, z izrazitejšim aneugenim delovanjem (pH3), spremembami v proliferaciji (Ki67) in povečanim oksidativnim stresom (8-OxoG, SRXN1). Zaključujemo, da je razviti mikroskopski pristop HTS zanesljiv, objektiven in visokopretočen, kar predstavlja robustno platformo za celostno toksikološko oceno onesnaževal zraka. Testirana PAH-a in njuna mešanica so izrazito biološko aktivni ter škodljivi za humane celične modele, pri čemer delujejo preko različnih prevladujočih mehanizmov (genotoksičnost ali oksidativni stres), kompleksnejši 3DD celični model pa bistveno poveča dovzetnost celic za škodljive učinke.[B. režonja]20262026-09-16 07:17:58Magistrsko delo/naloga187881sl