Vpliv promotorjev in signalnih zaporedij na produkcijo heterolognega proteina v kvasovki Komagataella phaffiiDautova, Daniela (Avtor) Petković, Hrvoje (Mentor) Štafa, Anamarija (Komentor) homologna rekombinacijakvasovkeKomagataella phaffiiPichia pastorisnanoteloheterologni proteinisignalno zaporedjeMetilotrofna kvasovka Komagataella phaffii se pogosto uporablja kot gostitelj za produkcijo heterolognih proteinov v biotehnološki industriji. Za optimizacijo sinteze heterolognega proteina sta ključnega pomena izbira ustreznega promotorja in signalnega zaporedja, ki omogoča izločanje iz celice, saj oba vplivata na končni donos produkta. Z namenom testiranja vpliva teh dveh elementov na izločanje ciljnega proteina smo s pomočjo metode kloniranja po Gibsonu konstruirali 12 plazmidnih konstruktov, ki smo jih uspešno vnesli v sev Komagataella phaffii PIPAg_0016. Primerjali smo raven izločanja ciljnega heterolognega proteina Ty1, uporabljeni plazmidi pa so kodirali različne promotorje (PAOX1 ali PUPP) in signalna zaporedja. Z analizo produkcije ciljnega proteina pred in po razbijanju celic smo ugotovili, da se večina proteina izloča v ekstracelularni prostor, le majhen del pa ostane v celici, kar je v industrijskih proizvodnih procesih zelo zaželeno. Izražanje heterolognega proteina Ty1 smo potrdili s poliakrilamidno elektroforezo v prisotnosti NaDS in imunodetekcijo proteina po prenosu western. Produkcija heterolognega proteina je bila višja ob uporabi promotorja PAOX1. Najvišjo koncentracijo ciljnega proteina smo detektirali pri uporabi plazmidnega konstrukta, ki je vseboval promotor PAOX1 in signalno zaporedje S3, ki kodira modificiran paritveni faktor alfa (α-MF) iz Saccharomyces cerevisiae. Z uporabo promotorja PUPP smo opazili najvišji titer proteina, če je le-ta v kombinaciji s signalnim zaporedjem S1, ki je nemodificiran α-MF iz S. cerevisiae. V obeh primerih pa pride do nepopolnega procesiranje signalnega peptida. Zato bi bilo signalno zaporedje, ki vodi do nižjega titra, vendar omogoča popolno procesiranje signalnega zaporedja, boljša izbira za proizvodnjo heterolognih proteinov.20262026-09-12 07:16:59Magistrsko delo/naloga187616sl