Validacija proteinskih interaktorjev proteina TDP-43Razboršek Fink, Klara (Avtor) Rogelj, Boris (Mentor) TDP-43validacijainterakcijski partnerjiALSProtein z molekulsko maso 43 kDa, ki se veže na transaktivacijski odzivni element molekule DNA (TDP-43), je DNA/RNA-vezavni protein iz družine heterogenih jedrnih ribonukleoproteinov. Sodeluje pri uravnavanju metabolizma RNA, transporta mRNA in uravnava izrezovanje več genov. Nahaja se lahko v jedru ali citoplazmi, pri čemer je njegova prisotnost v citoplazmi močno povezana s patološkimi procesi. Citoplazemski agregati proteina TDP-43 so najpogostejša nevropatološka značilnost amiotrofične lateralne skleroze (ALS). Proteinske interakcijske partnerje proteina TDP-43 tako v fizioloških kot tudi patoloških procesih so preučevali že v številnih raziskavah, vendar veliko število odkritih interaktorjev še ni validiranih. V sklopu magistrskega dela smo želeli ovrednotiti potencialne interaktorje ATXN2L, HNRNPK, NUP93 in SFPQ proteina TDP-43wt in TDP-43dNLS, oblike TDP-43 brez jedrnega lokalizacijskega signala, ki delno posnema obnašanje TDP-43 v patologiji. Validirati smo želeli interakcije s TDP-43wt oziroma TDP-43dNLS. V ta namen smo z metodo APEX2 preverjali prisotnost teh interaktorjev v eluatih po metodi »pull down«. Prav tako smo ovrednotili inducibilne ekspresijske celične linije HEK 293, ki stabilno izražajo proteina TDP-43wt in TDP-43dNLS v fuziji s fluorescenčnim proteinom mScarlet-myc. Ugotovili smo, da ima fuzijski protein TDP-43wt z mScarlet pričakovano jedrno lokalizacijo, TDP-43dNLS v fuziji z mScarlet pa citoplazemsko. Z imunodetekcijo smo po prenosu western zaznali interakcijske partnerje TDP-43wt in njegove mutante TDP-43dNLS. Po celični lizi smo izvedli celično frakcionacijo, s katero smo ločili citoplazemsko in jedrno frakcijo in z imunodetekcijo po prenosu western detektirali prisotnost interakcijskih partnerjev v posamezni frakciji. Te celice pa smo uporabili tudi za preparate in imunocitokemijo za natančnejšo lokalizacijo oblik TDP-43 in potencialnih interakcijskih partnerjev. Naši rezultati nakazujejo, da NUP93, HNRNPK in SFPQ interagirajo s TDP-43wt v jedru in v pogojih, ki posnemajo ALS, kolokalizirajo s TDP-43 v citoplazmo. ATXN2L pa je pridobljen interaktor TDP-43dNLS. Pridobljeni rezultati bodo pripomogli k razumevanju interaktoma TDP-43 in TDP-43dNLS.20262026-09-08 12:10:16Magistrsko delo/naloga187023sl