MERITEV FLUORESCENCE PRI METODI QPCRŠnajder, Jakob (Avtor) Možek, Matej (Mentor) fluorescencaqPCRfluoresceinSYBR Green Ilock-in ojačevalnikfazno-občutljiva detekcijatransimpedančni ojačevalnikKvantitativni PCR (qPCR) omogoča sprotno sledenje pomnoževanju DNK z merjenjem fluorescence interkalacijskega barvila, kot je SYBR Green I, vendar so komercialni qPCR-sistemi praviloma obsežne namizne naprave, neprimerne za terenske aplikacije. V okviru širšega projekta razvoja prenosnega (POC) qPCR-sistema je bila v diplomskem delu zasnovana, izdelana in ovrednotena osnovna fluorescenčna merilna veja tovrstnega sistema, katere namen je potrditi izvedljivost principa moduliranega vzbujanja z LED in fazno-občutljive detekcije z lock-in ojačevalnikom SIGNAL RECOVERY 7265 ter ugotoviti, do katerih vrednosti je zaznavanje z izbrano postavitvijo možno. Sistem sestavljajo svetlobni vir LED z valovno dolžino 490 nm, krmiljen z lastnim gonilnikom na osnovi modificirane Howlandove tokovne črpalke, linearni optični sistem z vzbujevalnim in emisijskim interferenčnim filtrom ter dvema plano-konveksnima lečama, silicijeva PIN-fotodioda TEMD5510FX01 ter dvostopenjski transimpedančni ojačevalnik. Mehanska izvedba sistema temelji na 3D-tiskanem ohišju in aluminijasti profilni konstrukciji. Končne meritve so bile izvedene s strojno sinhronizacijo funkcijskega generatorja in lock-in ojačevalnika: sinhronizacijski izhod generatorja HP 33220A je bil povezan na referenčni vhod TTL lock-in ojačevalnika SIGNAL RECOVERY 7265. Modulacijska frekvenca je bila nastavljena na 5,02 kHz, s čimer je bila meritev odmaknjena od točne vrednosti 5,00 kHz, ki predstavlja 100. harmonik omrežne frekvence 50 Hz. Po zaklepu se je fazni kot ustalil približno pri −109°. Meritve so bile izvedene pri občutljivostih LIA 50, 20, 10, 5 in 2 μV pri koncentracijah fluoresceina 10 μM, 100 μM in 1 mM ter pri količinah dodane raztopine 0,5, 1, 1,5 in 2 μL. Za slepi vzorec je bila v 5 μL mineralnega olja namesto fluoresceinske raztopine dodana enaka količina PBS. Pri občutljivosti 50 μV je bilo mogoče brez preobremenitve izmeriti celoten koncentracijski razpon, medtem ko so nižja merilna območja pri višjih koncentracijah prešla v preobremenitev. Za oceno meje zaznavnosti je bilo pri občutljivosti 2 μV opravljenih deset meritev slepega vzorca z 0,5 µL PBS. Povprečje je znašalo 82,3 nV, vzorčni standardni odklon 8,76 nV, prag R̄₀ + 3,3s₀ pa 111,2 nV. Najnižja preizkušena koncentracija, ki je še presegla ta prag in dala stabilen odčitek, je bila 2,5 µM; pri 1,25 µM je bil odziv pod pragom. Meja zaznavnosti je zato za uporabljeni diskretni niz koncentracij umeščena med 1,25 in 2,5 µM pri čemer 2,5 µM predstavlja najnižjo zanesljivo zaznano koncentracijo. Rezultati predstavljajo karakterizacijo fluorescenčne merilne veje, namenjene prihodnji integraciji v qPCR-sistem, in ne validacije celotne biokemijske qPCR-reakcije.20262026-09-08 11:10:03Diplomsko delo/naloga187017sl