Karakterizacija jedrnega uvoza proteina ORF1p retrotranspozona LINE-1Pervanja, Ana (Avtor) Župunski, Vera (Mentor) ORF1ptest jedrnega uvozakarioferiniDolgi razpršeni jedrni element 1 (LINE-1) je edini še aktivni retrotranspozon pri človeku in vsebuje zapisa za proteina ORF1p in ORF2p. Retrotranspozicija poteka po principu 'kopiraj in prilepi'. To pomeni, da se LINE-1 v jedru najprej prepiše v mRNA. Po prenosu v citoplazmo se prevede v proteine, ki z lastno mRNA tvorijo ribonukleoproteinski kompleks in se prenesejo nazaj v jedro. Tam nato poteka retrotranspozicija po principu na tarčnem mestu začete reverzne transkripcije. Znano je, da proces poteka tudi v nedelečih se celicah, npr. nevronih, zato morajo ORF1p, ORF2p in mRNA LINE-1 prehajati v jedro. Namen magistrskega dela je bil ugotoviti, kakšen je mehanizem jedrnega uvoza ORF1p. Najprej smo v bakterijah E. coli izrazili in izolirali rekombinantne proteine ORF1p, jedrni lokalizacijski signal velikega T-antigena iz opičjega virusa 40, karioferin alfa 6 (KPNA6), karioferin beta 1 (KPNB1) in Ran. Vsi so imeli na N-koncu fuzijo glutation-S-transferaze. Jedrni prenos smo preučevali s testom jedrnega uvoza, pri katerem smo celicam HeLa selektivno permeabilizirali celično membrano. Po odstranitvi citoplazme smo jedrom dodali uvozne mešanice, ki so vsebovale rekombinantni protein ORF1p, faktorje za vnos v jedro in sistem za vzdrževanje ravni ATP. Kot faktor za vnos v jedro smo najprej uporabili retikulocitni lizat in dokazali, da ORF1p v jedro prehaja aktivno ter da je prenos odvisen od prisotnosti karioferinov. Nato smo retikulocitni lizat nadomestili s posameznimi karioferini in proteinom Ran. Rezultati teh eksperimentov nakazujejo, da jedrni uvoz ORF1p verjetno poteka ob sodelovanju kompleksa KPNA6/KPNB1. Dobljeni rezultati prispevajo k razumevanju mehanizma jedrnega transporta ORF1p in s tem uravnavanja procesa retrotranspozicije LINE-1.20262026-09-08 10:05:11Magistrsko delo/naloga187011sl