Primerjava izbranih metod za določanje koagulacijskega dejavnika VIII in von Willebrandovega dejavnika v podporo kromatografskim postopkom njunega čiščenja iz plazmeLeban, Karolina (Avtor) Sollner Dolenc, Marija (Mentor) Begić Kokan, Marija (Komentor) analitske metodekoagulacijski dejavnik FVIIIplazemsko izvorni pripravki FVIII in vWFučinek matriksavon Willebrandov dejavnikHemostaza je fiziološki proces, ki ohranja kri v tekočem stanju in ob poškodbi žile omogoča zaustavitev krvavitve. Sestavljata jo primarna hemostaza z aktivacijo trombocitov in tvorbo trombocitnega čepa ter sekundarna hemostaza, ki temelji na aktivaciji koagulacijske kaskade, ki jo delimo na zunanjo in notranjo pot. Pri slednji ima ključno vlogo koagulacijski dejavnik VIII (FVIII), ki v plazmi kroži vezan na von Willebrandov dejavnik (vWF). Njuno pomanjkanje vodi v motnje strjevanja krvi, ki se zdravijo s plazemsko izvornimi pripravki FVIII in vWF, pridobljenimi z izolacijo iz plazme s precipitacijo in kromatografijo. V okviru postopka kromatografskega čiščenja je spremljanje koncentracije oziroma aktivnosti teh proteinov ključno za zagotavljanje ustrezne terapevtske učinkovitosti pripravkov. V ta namen smo FVIII določali s kromogeno in koagulacijsko metodo, vWF pa z imunoturbidimetrično in metodo ELISA. Metode smo s pomočjo standardov obeh proteinov primerjali z vidika analitskih značilnosti, kot sta ponovljivost in točnost. Rezultati so pokazali, da sta obe metodi za določanje FVIII dosegli ustrezno dnevno in meddnevno ponovljivost, pri čemer je koagulacijska metoda izkazovala boljšo ponovljivost in točnost v območju višjih aktivnosti FVIII, značilnih za realne procesne vzorce, kar je verjetno povezano z višjo stopnjo avtomatizacije postopka. Po kromatografskem čiščenju smo pridobili frakcije, ki so vsebovale FVIII v procesnih medijih različne sestave, predvsem glede na koncentracijo soli. Ker lahko sestava teh medijev vpliva na merjenje, smo metode dodatno primerjali tudi z vidika vpliva matriksa na določanje obeh proteinov. Rezultati so pokazali, da sestava procesnih medijev vpliva na analitski odziv metod. Pri večini metod smo v vzorcih, pripravljenih z redčenjem standardov v procesnem mediju z najvišjo koncentracijo soli, določili nižje aktivnosti oziroma koncentracije analitov, z izjemo metode ELISA, ki je izkazovala nasproten trend. Ocenili smo tudi možnost zmanjšanja vpliva procesnih medijev z dodatnim redčenjem in razsoljevanjem vzorcev. Dodatno redčenje ni izboljšalo analitskega odziva metod, kar je verjetno posledica napak pri pripravi višjih redčitev ter zmanjšane občutljivosti metod pri nizkih koncentracijah analita. Razsoljevanje, s katerim smo želeli odstraniti nizkomolekularne komponente, prav tako ni bilo ustrezno, saj je izguba analitov med postopkom povzročila pomembna odstopanja izmerjenih vrednosti.[K. Leban]20262026-09-05 08:46:12Magistrsko delo/naloga186815sl