Razvoj bioloških nanopor za zaznavanje medicinsko pomembnih proteinovSrnko, Marija (Avtor) Anderluh, Gregor (Mentor) porotvorni proteinizaznavanje z nanoporamihistoniPo uspešni uporabi nanopor za določanje zaporedja nukleinskih kislin se raziskave na tem področju usmerjajo v zaznavanje proteinov in določanje njihovega aminokislinskega zaporedja. Metoda temelji na zaznavi električnih tokov in njihovih sprememb ob prehajanju ionov in analitov skozi nanometrsko proteinsko poro, vstavljeno v električno neprevodno lipidno ali polimerno membrano. Med najpogosteje uporabljenimi biološkimi porami so porotvorni proteini, pri čemer je FraC edini aktinoporin, že uporabljen v ta namen. V okviru doktorskega raziskovalnega dela smo proučevali in za zaznavanje optimizirali pore aktinoporinom podobnega proteina iz morske korale Orbicella faveolata (Fav). Mutant RN1-Fav je kljub manj stabilnemu α-vijačnemu transmembranskemu delu v primerjavami z β-porotvornimi proteini izkazoval stabilno vgradnjo v polimerne planarne membrane in omogočil razločevanje histonov. Zunajcelične histone se namreč vse pogosteje omenja kot potencialne biomarkerje, katerih hitra, natančna zaznava v realnem času bi lahko nadomestila dosedanji tehniki zaznavanja s protitelesi in masno spektrometrijo. Naši rezultati kažejo, da so za opažene spremembe električnih tokov ob dodatku histonov H4, H3.1, H3K9ac, H3K23ac in H3Cit ključne elektrostatske interakcije med pozitivno nabitimi histoni in negativnim neto nabojem lumna pore. Dodatno smo s pomočjo modelnega učenja uspešno ločili blokade, pripadajoče histonom v mešanicah H4/H3Cit, H4/H3.1 in H4/H3Cit/H3K9ac. V primeru najpogosteje prisotnih serumskih histonov H3Cit in H4 smo pokazali, da je na podlagi frekvence dogodkov mogoče določiti tudi njihovo koncentracijo in razmerje v mešanici. Kljub nezmožnosti sočasnega zaznavanja vseh petih uporabljenih histonov pa robustnost pore na spremembe aminokislinskega zaporedja v lumnu pore predstavlja dobro izhodišče za nadaljnjo optimizacijo pore in zaznavanje histonov v veliko bolj kompleksnejših bioloških vzorcih, kot je serum.20262026-07-17 07:15:21Doktorsko delo/naloga184905sl