Interakcije med potivirusnim proteinom HCPro in vezavnim proteinom iz rastlinLeben, Klavdija (Avtor) Podobnik, Marjetka (Mentor) potivirusiprotein HCProproteinske interakcijetobačni proteinipull-downtermoforeza na mikroskaliPotivirusi predstavljajo obsežen rod rastlinskih RNA virusov, ki z okužbami širokega spektra gostiteljev povzročajo veliko gospodarsko škodo v kmetijstvu po celem svetu. Zaradi majhnega genoma kodirajo nabor večopravilnih proteinov, med katerimi ima osrednjo vlogo protein HCPro (angl. helper component-protease). Prek kompleksnih interakcij z virusnimi in gostiteljskimi proteini HCPro omogoča namnoževanje in razširjanje virusa ter hkrati zavira rastlinski obrambni sistem. Iz literature so že znane nekatere interakcije HCPro iz različnih potivirusov z rastlinskimi molekulami, ki so bile identificirane z uporabo raznolikih metodoloških pristopov. Namen magistrskega dela je bil v nadzorovanih pogojih in vitro kvalitativno in kvantitativno analizirati molekulske interakcije proteina HCPro virusa krompirja A (PVA) s petimi proteini navadnega tobaka (Nicotiana tabacum), in sicer z eIF(iso)4E, CF1β, MinD, WD40 in HIP2. Vse te proteine smo rekombinantno izražali v bakterijskem sistemu Escherichia coli, pri čemer smo zaradi neustrezne ekspresije oziroma topnosti MinD, WD40 in HIP2 nadaljnje eksperimentalno delo omejili na eIF(iso)4E in CF1β. Za slednja smo z uvedbo dodatne polihistidinske oznake uspešno optimizirali protokol izolacije in čiščenja. Njuno čistost smo preverili s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecil sulfata, strukturno ustreznost in stabilnost pa z nativno poliakrilamidno gelsko elektroforezo, dinamičnim sipanjem svetlobe, cirkularnim dikroizmom in diferenčno dinamično fluorimetrijo. Z metodo pull-down smo potrdili neposredno interakcijo obeh proteinov s HCPro, z metodo termoforeze na mikroskali pa določili afiniteto vezave. Vrednosti disociacijskih konstant v nizkem mikromolarnem območju izkazujejo specifičnost in prehodno naravo teh interakcij. Ugotovitve predstavljajo pomemben temelj za nadaljnje strukturne in funkcijske raziskave interakcij med virusnimi in rastlinskimi (gostiteljskimi) molekulami.[K. Leben]20262026-07-10 07:15:20Magistrsko delo/naloga184556sl