Kloniranje in izolacija ORF1p iz LINE1 z vezavnim proteinom za maltozoKramar, Zala (Avtor) Župunski, Vera (Mentor) ORF1pLINE1izolacijaALSFTDProtein ORF1p iz retrotranspozona LINE1, edinega aktivnega avtonomnega retrotranspozona v človeškem genomu, je približno 40 kDa velik RNA-vezavni protein z aktivnostjo šaperona nukleinskih kislin. V zadnjih letih ima vse večji pomen v raziskavah, ki so povezane z nevrodegenerativnimi boleznimi. Cilj diplomske naloge je bil izraziti in izolirati protein ORF1p v zadostni količini za nadaljnje eksperimente, kot je test jedrnega uvoza. Pripravili smo vektorja pMCSG7-MBP-ORF1p (N-končna fuzija z MBP in His6) za izražanje zapisa za MBP-ORF1p ter pMCSG7-ORF1p-MBP (C-končna fuzija z MBP in His6) za izražanje zapisa za ORF1p-MBP. Oznaka His6 je omogočila izolacijo proteina z afinitetno kromatografijo na imobiliziranih kovinskih ionih (IMAC), medtem ko je MBP omogočil izolacijo z MBP-afinitetno kromatografijo na dekstrin-sefarozni koloni. Konstrukt ORF1p-MBP se je med izražanjem in izolacijo razgradil v večji meri kot MBP-ORF1p. MBP-ORF1p smo z obema metodama izolirali s primerljivo čistostjo. V obeh primerih je bilo v elucijskih frakcijah prisotnih veliko razgradnih produktov MBP-ORF1p, kar smo potrdili z imunodetekcijo. Sklepali smo, da je vzrok razgradnje proteina prisotnost intrinzično neurejenih regij na ORF1p, ki so bolj dovzetne za proteolizo. Postopek izolacije smo delno izboljšali z dodatkom glicerola v vezavne in elucijske pufre. Postopke bi morali dodatno optimizirati in zmanjšati aktivnost proteaz. Oznako His6-MBP smo z MBP-ORF1p uspešno odstranili s proteazo TEV.20262026-07-09 13:10:03Diplomsko delo/naloga184540sl