Vpliv RNA-ponovitev (G$_4$C$_2$)$_{48}$ na ločitev faz tekoče-tekoče v raztopinah proteinov DAZAP1 in HNRNPH3Sušnik, Rok (Avtor) Župunski, Vera (Mentor) DAZAP1HNRNPH3ločitev faz tekoče-tekočeparapegeRNA-ponovitveHeksanukleotidne RNA-ponovitve GGGGCC (G$_4$C$_2$) so vpletene v razvoj amiotrofične lateralne skleroze in frontotemporalne demence. Nanje se vežejo različni RNA-vezavni proteini, s čimer pride do njihove sekvestracije ali celo agregacije. Ker so ti proteini pogosto transkripcijski faktorji, to vpliva na uravnavanje izražanja genov. Po strukturi in funkciji so ti skupki RNA in proteinov podobni parapegam, jedrnim nemembranskim organelom, ki nastanejo kot odziv na celični stres in uravnavajo izražanje genov s sekvestracijo proteinov. Dva izmed proteinov, ki se nahajata v parapegah, sta z DAZ povezan protein 1 (DAZAP1) in heterogeni jedrni ribonukleoprotein H3 (HNRNPH3). RNA prepoznavni motivi in strukturno neurejene regije, ki jih vsebujeta, omogočajo ločitev faz tekoče tekoče, s katero nastanejo parapege. Preverili smo, ali RNA-ponovitve (G$_4$C$_2$)$_{48}$ povzročijo ločitev faz tekoče-tekoče teh dveh proteinov. Za izražanje zapisov za DAZAP1 in HNRNPH3 v E. coli smo pripravili rekombinantna konstrukta na osnovi vektorja pJ4M, ki je vseboval zapisa za C-končno fuzijo maltozo vezavnega proteina in heksahistidinsko oznako. Po indukciji izražanja smo proteina izolirali z nikljevo afinitetno kromatografijo. RNA-ponovitve (G$_4$C$_2$)$_{48}$ smo pripravili s transkripcijo in vitro. Ločitev faz tekoče-tekoče smo opazovali z mikroskopijo z diferencialnim interferenčnim kontrastom (DIC). Ugotovili smo, da RNA ponovitve (G$_4$C$_2$)$_{48}$ povzročijo ločitev faz tekoče-tekoče tako pri DAZAP1 kot tudi pri HNRNPH3. Poleg tega se DAZAP1 fazno loči tudi v prisotnosti 5-% polietilen glikola, ki posnema učinek molekulskega nagnetenja, značilnega za celico. Za ločitev faz tekoče-tekoče pri HNRNPH3 je bila potrebna bistveno višja koncentracija RNA kot pri DAZAP1, fazno ločene kapljice pa so bile po velikosti majhne in prisotne v nizkem številu, zato bi rezultate morali preveriti še z drugimi metodami. Eksperiment bi bilo smiselno ponoviti tudi z uporabo fluorescenčno označenih proteinov, s čimer bi lahko potrdili vezavo DAZAP1 in HNRNPH3 na RNA ponovitve (G$_4$C$_2$)$_{48}$ ter preučili njuno morebitno kolokalizacijo v celici.20262026-07-08 10:45:01Diplomsko delo/naloga184483sl