Vzpostavitev bakterijskega sistema LexKan za selekcijo afiteles, ki inhibirajo tvorbo homodimerov proteaze Mpro iz SARS‑CoV‑2Kogovšek, Jan (Avtor) Novinec, Marko (Mentor) afitelobakterijski sistem LexKanproteaza MproSARS-CoV-2Pandemija COVID-19 je izpostavila nujnost razvoja novih terapevtskih strategij proti virusnim okužbam, zlasti v primerih, ko klasična protivirusna zdravila niso učinkovita. Glavna proteaza SARS-CoV-2 (Mpro) je uveljavljena terapevtska tarča, saj je bistvena za proteolitično procesiranje virusnih poliproteinov, potrebnih za replikacijo virusa. Njena katalitična aktivnost je strogo odvisna od homodimerizacije, zato dimerizacijska površina predstavlja zanimivo alternativno mesto za inhibicijo. V magistrskem delu smo vzpostavili in validirali nov bakterijski selekcijski sistem LexKan, ki omogoča fenotipsko selekcijo afiteles na podlagi preživetja celic E. coli v prisotnosti kanamicina. Z uporabo kontrolnih proteinov smo optimizirali selekcijske pogoje in potrdili delovanje sistema tako v tekočem kot na trdnem gojišču. Pripravili smo knjižnico afiteles z naključno mutagenezo 13 površinsko izpostavljenih aminokislin ter izvedli selekcijo kandidatov za inhibitorje dimerizacije Mpro. Izbranih šest afiteles in en afipeptid smo uspešno izrazili, izolirali in okarakterizirali. Eksperimentalna analiza z velikostno izključitveno kromatografijo in masno fotometrijo je pokazala, da je Mpro pri nižjih koncentracijah pretežno prisotna kot homodimer, pri višjih koncentracijah pa tvori tudi višje oligomerne oblike. Prisotnost afitelesa 4 je povzročila koncentracijsko odvisno zmanjšanje deleža dimera, kar kaže na delno destabilizacijo homodimerizacije. Nadaljnja bioinformatska analiza z orodji AlphaFold, PDBePISA in HADDOCK je pokazala, da se afitelo 4 najverjetneje veže na dimerizacijsko površino Mpro ter med vsemi analiziranimi kandidati izkazuje najugodnejše interakcije. Rezultati kažejo, da afitelo 4 predstavlja obetavnega kandidata za nadaljnjo optimizacijo kot potencialni inhibitor proteaze Mpro in posledično replikacije SARS-CoV-2.20262026-07-01 13:00:04Magistrsko delo/naloga184196sl