Karakterizacija Nef-vsebujočih zunajceličnih veziklov iz mikroglij in limfocitov T in njihov vpliv na živčne matične celiceLavrin, Teja (Avtor) Lenassi, Metka (Mentor) Virus humane imunske pomanjkljivosti (HIV)mikroglijalimfociti Tprotein Nefzunajcelični vezikli (ZV)človeške živčne predniške celice (hNPC)diferenciacijas HIV povezane nevrokognitivne motnje (HAND)Ozadje: Okužba z virusom humane imunske pomanjkljivosti tipa 1 (HIV-1) se je iz bolezni s smrtnim izidom preoblikovala v kronično stanje, saj več kot 70 % zdravljenih posameznikov dosega dolgotrajno supresijo virusa. Kljub uspešni kombinirani protiretrovirusni terapiji (ART) ostajajo pomemben klinični problem pridružene bolezni, ki povzročajo spekter kognitivnih, motoričnih in vedenjskih motenj, znanih kot s HIV povezane nevrokognitivne motnje (HAND). Eden ključnih dejavnikov njihove patogeneze je prisotnost virusnih rezervoarjev v osrednjem živčevju (OŽ), zlasti v mikroglijah, kjer se izražajo virusni proteini, kot je Nef. V okviru doktorske naloge smo želeli opredeliti vlogo proteina Nef pri sproščanju in lastnostih zunajceličnih veziklov (ZV) ter vpliv Nef-ZV na živčne predniške celice (hNPC), ki imajo tudi nekatere lastnosti matičnih celic. Hipoteze: Zastavili smo naslednje hipoteze: (i) da izražanje Nef v mikroglijah vpliva na biofizikalne in molekularne lastnosti sproščenih zunajceličnih veziklov; (ii) da izražanje Nef v limfocitih T vpliva na biofizikalne in molekularne lastnosti sproščenih zunajceličnih veziklov in (iii) da zunajcelični vezikli, ki vsebujejo Nef, vplivajo na apoptozo, proliferacijo in/ali diferenciacijo živčnih matičnih celic. Metode: V študiji smo kot vir ZV uporabili celice človeških mikroglij (h-MG) in nesmrtne limfocite T (Jurkat), kot model živčnih matičnih celic pa hNPC. Z uporabo lentivirusnih vektorjev z inducibilnim sistemom TET-ON smo vzpostavili stabilni celični liniji h-MG in Jurkat, ki izražata protein Nef.GFP (oziroma GFP kot kontrolo). Izražanje proteinov smo preverili s pretočno citometrijo in fluorescenčno mikroskopijo. ZV smo izolirali iz celičnih kultur z diferencialnim ultracentrifugiranjem in jih dodatno očistili z gostotnim jodiksanolnim gradientom. Njihove biofizikalne lastnosti smo analizirali z metodo sledenja nanodelcem (NTA), nano-pretočno citometrijo in presevno elektronsko mikroskopijo (TEM), molekularno sestavo pa s prenosom western (proteini) ter nano-pretočno citometrijo (lipidi). Prisotnost proteina Nef v ZV smo dodatno določili s TEM v kombinaciji z imunooznačevanjem, nano-Nef ELISO in nano-pretočno citometrijo. Funkcionalne učinke ZV smo ovrednotili na hNPC s testiranjem metabolne aktivnosti, proliferacije, apoptoze in diferenciacije. V ta namen smo uporabili celične teste na osnovi fluorescence (metabolna aktivnost, proliferacija, apoptoza, nekroza) in luminescence (apoptoza) ter spremljali izražanje specifičnih označevalcev s fluorescenčno mikroskopijo in pretočno citometrijo. Vsi poskusi so vključevali ustrezne kontrole in ponovitve, rezultate pa smo analizirali z osnovnimi statističnimi metodami. Rezultati: V naši raziskavi smo vzpostavili izboljšana celična modela translacijsko aktivnih rezervoarjev HIV-1, ki omogočata stabilno in nadzorovano izražanje proteina HIV-1 Nef.GFP v celicah h-MG in Jurkat. Pokazali smo, da Nef.GFP selektivno spodbuja sproščanje ZV iz celic h-MG in Jurkat s specifičnimi biofizikalnimi (večje število, majhni, s tipično morfologijo in gostoto) in molekularnimi (obogateni z Nef, vezikularnimi proteini in lipidi značilnimi za lipidne rafte) lastnostmi. Z uporabo analiz na ravni posameznih veziklov smo pokazali, da je Nef.GFP prisoten v največ polovici Nef-ZV, medtem ko smo s TEM in dodatno imunooznačitvijo določili njegovo lokalizacijo na luminalni strani ZV. V okviru naloge smo prvič preučevali funkcionalno vlogo Nef-ZV na hNPC, s posebnim poudarkom na vplivu na diferenciacijo v astrocite. Nakazali smo, da Nef-ZV iz h-MG in rNef pri delu populacije hNPC spodbujata diferenciacijo v astrocite, v drugem delu populacije pa povečujeta proliferacijo. Poleg tega smo rNef povezali s povečano stopnjo apoptoze in nekroze pri hNPC, ki so bili usmerjeni v diferenciacijo v astrocite, medtem ko pri Nef, pakiranem v ZV, takšnega učinka nismo zaznali. Naša študija kaže na vlogo Nef-ZV pri uravnavanju celičnega stanja hNPC, vendar so za natančnejšo opredelitev te vloge potrebni dodatni neodvisni biološki poskusi. Zaključki: V doktorski nalogi smo pokazali, da izražanje Nef vpliva na biofizikalne in molekularne lastnosti sproščenih ZV iz mikroglij in limfocitov T, in s tem potrdili prvo in drugo hipotezo. Rezultati prav tako nakazujejo, da ZV, izolirani iz mikroglij in limfocitov T, vplivajo na apoptozo, proliferacijo in diferenciacijo hNPC, uporabljenih kot model živčnih matičnih celic, s čimer smo deloma potrdili tretjo hipotezo. Prispevek k znanosti: Naši rezultati prispevajo k boljšemu razumevanju vloge Nef in Nef-vsebujočih ZV v OŽ ter nakazujejo potencialne mehanizme, povezane z razvojem HAND, ki bi jih bilo smiselno dodatno raziskati v kompleksnejših eksperimentalnih modelih. S tem naše ugotovitve odpirajo možnosti za nadaljnje raziskave medcelične komunikacije ter potencialno razvoj ciljno usmerjenih terapevtskih pristopov.20262026-06-17 14:05:17Doktorsko delo/naloga183696sl