Izražanje in izolacija transpeptidaznih encimov, vpletenih v biosintezo peptidoglikanaMesarič, Katja (Avtor) Hrast Rambaher, Martina (Mentor) Cingl, Jernej (Komentor) transpeptidazepeptidoglikanbakterijska odpornostrekombinantni proteiniafinitetna kromatografijaLdtBPBP1bPBP3Bakterijska odpornost proti protibakterijskim učinkovinam predstavlja pomemben javnozdravstveni problem, ena najbolj učinkovitih strategij pri boju proti vztrajnemu širjenju bakterijske rezistence pa je razvoj novih protibakterijskih učinkovin. Med najbolj pomembne tarče sodijo transpeptidazni encimi, ki sodelujejo pri prečnem povezovanju peptidoglikana in s tem zagotavljajo stabilnost bakterijske celične stene. Namen magistrske naloge je bil izraziti in izolirati tri transpeptidazne encime, vključene v biosintezo peptidoglikana, in sicer L,D-transpeptidazo B (LdtB) iz Escherichia coli, penicilin vezoči protein 1b (PBP1b) iz Streptococcus pneumoniae ter penicilin vezoči protein 3 (PBP3) iz Escherichia coli. Za izražanje rekombinantnih proteinov smo uporabili ekspresijski sev E. coli NiCo21 (DE3). Kompetentne celice smo transformirali s plazmidi z metodo toplotnega šoka, uspešnost transformacije pa smo potrdili s selekcijskimi gojišči z antibiotikom. Izolacijo proteinov smo izvedli z afinitetno kromatografijo, dodatno čiščenje pa s kromatografijo z ločevanjem po velikosti. Čistost proteinov smo ovrednotili z metodo SDS-PAGE, njihovo aktivnost pa preverili z ustreznimi fluorescenčnimi in vezavnimi testi. V okviru magistrske naloge smo uspešno izrazili in izolirali 99,3 mg encima LdtB ter potrdili njegovo encimsko aktivnost s fluorescenčnim testom aktivnosti. Uspešno smo izrazili in izolirali tudi PBP1b, vendar pri testiranju proteina nismo uspeli potrditi pričakovane biološke aktivnosti. Pri izražanju PBP3 smo s sekvenciranjem po Sangerjevi metodi potrdili prisotnost ustreznega genskega zapisa v plazmidu in izrazili manjše količine proteina, vendar zaradi nizkega izkoristka nismo uspeli pridobiti zadostne količine ustrezno čistega PBP3. LdtB, ki smo ga uspešno izrazili in izolirali tekom magistrske naloge, bo predstavljal osnovo za nadaljnje testiranje potencialnih novih protibakterijskih učinkovin na Katedri za farmacevtsko kemijo Fakultete za farmacijo Univerze v Ljubljani.[K. Mesarič]20262026-06-17 08:45:42Magistrsko delo/naloga183665sl