Analiza vezave proteinov družine FHL na β-kateninŠegota, Luka (Avtor) Gaber, Aljaž (Mentor) proteinske interakcijeproteinska družina FHLβ‑kateninITCSEC-SLSSignalna pot Wnt ima ključno vlogo pri uravnavanju celične proliferacije, diferenciacije in homeostaze tkiv. Njena deregulacija je tesno povezana z razvojem številnih rakavih obolenj. Osrednji mediator kanonične poti Wnt je protein β-katenin, ki v jedru deluje kot transkripcijski koaktivator in s tem uravnava izražanje tarčnih genov. Med njegovimi vezavnimi partnerji je tudi protein FHL2 (angl. four and a half LIM domain protein 2). Kljub biološkemu pomenu kompleksa β-katenin: FHL2, molekularni mehanizmi njune interakcije še niso v celoti pojasnjeni. FHL2 je eden izmed štirih strukturno sorodnih članov družine FHL (FHL1, FHL3 in FHL5), katerih primerjava omogoča vpogled v strukturne in funkcionalne dejavnike, ki določajo specifičnost vezave na β-katenin. V eksperimentalnem delu smo najprej pripravili rekombinantne proteinske konstrukte za člane družine FHL ter vzpostavili oziroma optimizirali protokole njihovega izražanja v bakterijskem ekspresijskem sistemu in čiščenja. Posebno pozornost smo namenili proteinu FHL5, ki je kazal izrazito nizko topnost, zato smo preizkusili različne pogoje izražanja in lize, vključno s prilagoditvijo pH, spreminjanjem koncentracije Zn²⁺ ionov ter uporabo plazmida pRARE2. Po pridobitvi zadostnih količin proteinov smo njihove interakcije z β kateninom analizirali z izotermno titracijsko kalorimetrijo (ITC) in gelsko izključitveno kromatografijo sklopljeno z detektorjem za statično sipanje svetlobe (SEC SLS), kar nam je omogočilo oceno afinitete in stabilnosti potencialnih kompleksov. Eksperimentalne analize smo dopolnili z bioinformacijskimi pristopi: s primerjavo zaporedij, oceno topnostnega potenciala, analizo elektrostatskih lastnosti ter primerjavo napovedanih tridimenzionalnih modelov domen LIM. Uspelo nam je očistiti zadostno količino proteinov FHL1 in FHL3, kar je omogočilo njuno uporabo v interakcijskih analizah. Izplen topnega FHL5 je ostal omejen in je predstavljal glavno eksperimentalno omejitev. Interakcijske študije so pokazale, da kompleks FHL3:β katenin tvori šibkejšo in prehodno interakcijo z ocenjeno disociacijsko konstanto v velikostnem razredu približno 10 µM ali šibkejše, medtem ko za FHL1 vezave nismo zaznali. Zaradi omejene razpoložljivosti FHL5 njegove vezave nismo mogli eksperimentalno ovrednotiti. Rezultati so pokazali, da se člani družine FHL razlikujejo v izražanju, topnosti in interakcijskem obnašanju, bioinformacijske analize pa, da so domene LIM strukturno ohranjene, medtem ko se razlikujejo predvsem v površinskih lastnostih. Ugotovili smo, da se LIM domene bolj združujejo glede na svojo pozicijo kot glede na pripadnost posameznemu proteinu, kar podpira modularno evolucijo teh proteinov. Razlike v izoelektričnih točkah domen in celotnih proteinov dodatno kažejo na različne elektrostatske profile, ki lahko prispevajo k razlikam v interakcijah z β-kateninom.20262026-05-04 15:05:03Magistrsko delo/naloga182234sl