​Učinki lantanoidnih ionov na strukturo in lastnosti metaloencima paraoksonaza 1Smerkolj, Janez (Avtor) Goličnik, Marko (Mentor) Pavšič, Miha (Komentor) paraoksonaza 1lantanoiditerbijfosforescencaternarni kompleksParaoksonaza 1 (PON1) je ključen od Ca2+ ionov odvisen hidrolitičen encim, vezan na lipoproteine visoke gostote (HDL), katerega aktivnost in koncentracija sta tesno povezani s številnimi bolezenskimi stanji oksidativnega stresa, vključno s srčno-žilnimi in nevrodegenerativnimi obolenji. Kljub intenzivnim raziskavam še ne poznamo zanesljive metode za neposredno koncentracijsko kvantifikacijo PON1 v bioloških tekočinah. Obstoječi pristopi se zanašajo zgolj na merjenje kinetične aktivnosti z ne-fiziološkimi substrati ali nezanesljivimi encimsko vezanimi imunskimi testi. Namen doktorskega dela je bil postaviti temeljne raziskave o izmenjavi Ca2+ ionov z lantanoidnimi ion ter vezavo aromatskih ligandov v aktivno mesto PON1, ki bi lahko zaradi luminescenčne narave lantanoidov lahko bili uporabni za koncentracijsko kvantifikacijo encima. V doktorskem delu smo sistematično pojasnili, kako vezava Tb3+ ionov vpliva na encimsko aktivnost rekombinantnega encima PON1 (rePON1) in v nadaljevanju njegove fotofizikalne lastnosti ob tvorbi ternarnega kompleksa z 2-hidroksikinolinom (2HQ). Pokazali smo, da Tb3+ ioni reverzibilno inhibirajo laktonazno aktivnost rePON1 po zaporednem dvostopenjskem mehanizmu, ki vključuje tako katalitsko kot strukturno vezavno mesto. S kinetičnim modeliranjem progresivnih krivulj hidrolize substrata dihidrokumarina smo potrdili takojšnjo, nizkoafinitetno zamenjavo katalitskega Ca2+ iona (KI1 = 0,48 μM), ki ji sledi počasna, visokoafinitetna zamenjava na strukturnem mestu (KI2 = 0,91 nM). Presežek Ca2+ ionov inhibiran encim reaktivira, kar nakazuje na ohranitev zgradbe proteina ob zamenjavi ionov. V osrednjem delu smo pokazali, da 2HQ z rePON1 in Tb3+ ioni tvori fotoluminiscenčni ternarni kompleks rePON1:Tb3+:2HQ, ki izkazuje značilno, od Tb3+ ionov odvisno časovno zamaknjeno fosforescenco z emisijski vrhovi pri karakterističnih valovnih dolžinah. Intenziteta fosforescenčnega signala linearno sovpada s koncentracijo rePON1, kar bi lahko omogočalo neodvisno koncentracijsko kvantifikacijo PON1. Kristalna struktura rePON1:Tb3+:2HQ z ločljivostjo 2,35 Å (PDB 9R0Q) je razkrila delno zamenjavo Ca2+ ionov s Tb3+ ioni na katalitskem mestu (47 %), medtem ko je zasedenost na strukturnem mestu pri uporabljenih pogojih nizka (5 %). Inhibitor 2HQ se veže na enak način kot v Ca2+-kompleksu, brez večjih strukturnih odklonov. Z metodo izotermne titracijske kalorimetrije (ITC) smo termodinamsko potrdili, da se 2HQ na kompleks rePON1:Tb3+ veže bistveno šibkeje kot na kompleks rePON1:Ca2+ (približno 30-krat). Do podobnih rezultatov za vezavo 2HQ na kompleks rePON1:Tb3+ smo prišli tudi s titracijo 2HQ ob merjenju fosforescenčnega signala nastalega kompleksa rePON1:Tb3+:2HQ. V doktorski nalogi smo postavili strukturne in mehanistične temelje za uporabo fotoluminiscenčnih lantanoidnih kompleksov za kvantifikacijo encima PON1. Nadaljnje raziskave bi se morale usmeriti v iskanje in razvoj aromatskih ligandov z višjo afiniteto za kompleks rePON1:Tb3+, saj ligandi z nizko afiniteto za popolno zasedenost aktivnih mest PON1 zahtevajo visoke koncentracije le-teh, kar lahko vodi v dušenje lastne fosforescence (angl. self-quenching) ter zmanjšanje intenzitete in zanesljivost signala. Zato smo izvedli tudi netarčne presejalne teste ligandov iz knjižnice 1409 zdravil, ki so bila odobrena na kitajskem trgu s strani nacionalne uprave za medicinske pripomočke (angl. National Medical Products Administration). Pri tem smo odkrili dve farmakološki spojini prulifloksacin in efavirenz, ki sta izkazali za 2- do 3-krat višjo afiniteto do rePON1 kot 2HQ. To je dobro temeljno izhodišče za nadaljnje korake tudi pri vzpostavljanju sistema na detekcijo endogenega PON1 v kompleksnih bioloških vzorcih.20252026-03-25 08:15:23Doktorsko delo/naloga181095sl