Vpliv bisfenola A na viabilnost in izražanje genov apoptoze in steroidogeneze v celicah granuloze iz foliklove tekočine in tumorskih celicah celične linije KGN v pogojih in vitroCelar Šturm, Dominika (Avtor) Virant Klun, Irma (Mentor) Geršak, Ksenija (Komentor) Bisfenol ABPAJajčnikFolikelCelice granulozeCelice KGNSteroidogenezaApoptozaHormonski motilciEstradiolProgesteronIzvleček Uvod: Bisfenol A (BPA) je hormonski motilec, ki preko okoljske izpostavljenosti, predvsem sproščanja iz plastike, vstopa v človeško telo, kjer lahko zaradi svoje sposobnosti vezave na estrogenske receptorje deluje kot hormonski motilec in negativno vpliva na reproduktivno zdravje. V raziskavi smo preučevali vpliv BPA na »zdrave« celice granuloze iz foliklove tekočine, ključne gradnike jajčnikovih foliklov in tumorske celice granuloze iz celične linije KGN. Zanimal nas je učinek BPA na celično število, viabilnost in izražanje genov, povezanih z apoptozo in steroidogenezo, preverili pa smo tudi njegov vpliv na sproščanje estradiola in progesterona v rastno gojišče z analizo gojišča po zaključenem gojenju celic. Metode: Foliklovo tekočino smo po podpisanem informiranem pristanku pridobili od treh bolnic, udeleženih v postopek zunajtelesne oploditve zaradi moške neplodnosti. Celice granuloze smo iz foliklove tekočine izolirali z uporabo centrifugiranja na gradientu 50 % PureSperm (Nidacon, Švedska), nato pa jih nacepili in gojili v standardnih pogojih v rastnem gojišču DMEM-F12 z dodanim telečjim fetalnim serumom in antibiotiki na enak način kot tumorske celice granuloze KGN. V raziskavi smo pri dveh časovnih izpostavitvah (24 in 72 h) uporabili tri različne koncentracije BPA, dve koncentraciji (0,001 in 0,1 µM), primerljivi z izmerjenimi koncentracijami v različnih bioloških vzorcih človeka, ter toksikološko koncentracijo (100 µM), s katero smo želeli preveriti morebitne citotoksične učinke. Število in viabilnost celic smo izmerili s pomočjo avtomatskega števca celic in barvila tripansko modrilo, rast celic KGN pa smo spremljali tudi s fazno kontrastno mikroskopijo v časovnih presledkih. Izražanje genov, povezanih z apoptozo in steroidogenezo, smo analizirali z metodo verižne reakcije s polimerazo v realnem času (RT-qPCR) s predpripravljenimi ploščami za sočasno, hkratno analizo 96 genov, udeleženih v apoptozi (TaqManTM Array, Human Cellular Apoptosis Pathway, Fast 96-well, Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific, ZDA), in 96 genov, udeleženih v steroidogenezi (TaqManTM Array, Human Estrogens, Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific, ZDA) v primerjavi s kontrolo, nadalje pa smo za izbrane gene analizirali izraženost pripadajočih proteinov z metodo prenosa Western. Koncentracijo estradiola in progesterona v gojišču smo analizirali z elektrokemiluminiscenčnim imunskim testom (ECLIA). Rezultate smo statistično vrednotili z metodama enosmerna in dvosmerna ANOVA. Rezultati: BPA po 24-urni izpostavitvi celic ni vplival na noben izbrani parameter celic in pri nobenem celičnem modelu. Po 72 h je BPA pri najvišji koncentraciji (100 µM) tako pri celicah granuloze iz foliklove tekočine kot pri tumorskih celicah KGN povzročil statistično značilno zmanjšano viabilnost, pri nižjih koncentracijah pa nismo zaznali statistično značilnega vpliva v primerjavi s kontrolo. BPA je pri vseh koncentracijah statistično značilno (p < 0,05) vplival na izražanje genov, povezanih tako z apoptozo kot steroidogenezo, vendar so se ti geni večinoma razlikovali med celicami granuloze iz foliklove tekočine in tumorskimi celicami KGN. Med geni, povezanimi z apoptozo, smo pri koncentraciji 0,001 µM BPA v celicah granuloze iz foliklove tekočine zaznali povečano izražanje gena PPID in zmanjšano izražanje genov CASP3 in RPS6KA3, pri koncentraciji 0,1 µM BPA pa povečano izraženost genov BID, PPID in IKBKG ter zmanjšanje izraženosti gena CASP3 v primerjavi s kontrolo. Najvišja koncentracija BPA (100 µM) je povzročila statistično značilno povečano izražanje genov BID, PPID, IKBKG in težnjo k povečani izraženosti gena CASP3. Pri celicah KGN smo vpliv BPA na izraženost genov, povezanih z apoptozo, zaznali le pri najvišji koncentraciji 100 µM, kjer smo ugotovili povečano izražanje genov RIPK1, RPS6KA5 in težnjo k povečani izraženosti genov FADD in BBC3. Med geni, povezanimi s steroidogenezo, smo v celicah granuloze iz foliklove tekočine pri izpostavljenosti 0,001 µM BPA zaznali značilno povečano izražanje gena NR6A1 in zmanjšano izražanje genov UGT2B15 in TRIM25, pri koncentraciji 0,1 µM BPA pa povečano izraženost genov AR in HSD3B1 ter zmanjšano izraženost gena TRIM25. Pri najvišji koncentraciji BPA (100 µM) smo ugotovili statistično značilno povečano izražanje genov AR, CYP1B1 in GPR30 in sočasno zmanjšano izražanje genov FOXO1 in UGT2B15 v primerjavi s kontrolo. Pri tumorskih celicah KGN smo vpliv BPA na izražanje genov, povezanih s steroidogenezo, zaznali le pri srednji in najvišji koncentraciji BPA, kjer smo ugotovili zmanjšano izražanje gena CYP11A1 pri 0,1 µM BPA in povečano izraženost genov ESRRA, FOXO1, OVGP1 in GPR30 pri 100 µM BPA. Tudi pri merjenju koncentracije estradiola in progesterona, sproščenega v gojišče, smo vpliv zaznali le pri najvišji koncentraciji BPA (100 µM). Toksikološka koncentracija BPA je povzročila statistično značilno nižjo koncentracijo estradiola in progesterona v rastnem gojišču pri celicah granuloze iz foliklove tekočine, kar smo za progesteron potrdili tudi po normalizaciji na 1000 živih celic, za estradiol pa ne. Zaključek: V raziskavi je BPA izkazal citotoksični učinek na število in viabilnost celic granuloze iz foliklove tekočine in negativno vplival na sproščanje estradiola in progesterona v gojišče le pri najvišji koncentraciji 100 µM, učinek na izraženost analiziranih genov, povezanih z apoptozo in steroidogenezo, pa je bil opazen tudi pri nižjih koncentracijah BPA. Spremembe v izražanju genov so se razlikovale glede na koncentracijo BPA in celični model. Med geni, povezanimi z apoptozo, bi izpostavili povečano izražanje pro-apoptotskega gena BID v celicah granuloze iz foliklove tekočine, izpostavljenih 0,1 µM ali 100 µM BPA. Med geni, povezanimi s steroidogenezo, pa je izpostavljenost celic BPA predvsem povečevala izraženost genov za hormonske receptorje: receptor za androgene (AR) pri celicah granuloze iz foliklove tekočine, z estrogenom povezan receptor (ESSRA) pri tumorskih celicah KGN in za z G-proteinom povezan receptor za estrogen (GPR30), tako pri celicah granuloze iz foliklove tekočine kot tudi tumorskih celicah KGN. Negativne učinke BPA smo pri vseh meritvah opazili šele po daljši izpostavljenosti celic, tj. 72 ur, kar kaže na to, da se učinki BPA večajo s časom izpostavljenosti. Celice granuloze iz foliklove tekočine so se izkazale za bolj občutljive kot tumorske celice KGN, saj smo spremembe v izražanju genov, povezanih z apoptozo in steroidogenezo, zaznali pri vseh koncentracijah BPA, pri tumorskih celicah KGN pa razen enega gena samo pri najvišji koncentraciji BPA 100 µM.20262026-03-19 07:16:38Doktorsko delo/naloga180891sl