Določanje različic v genih IDH1 in IDH2 s sekvenciranjem po SangerjuBudisavljević, Barbara (Avtor) Podgornik, Helena (Mentor) Šućurović, Sandra (Komentor) akutna mieloična levkemijamielodisplastične novotvorbeizocitrat dehidrogenazasekvenciranje po Sangerjutočkovna mutacijaIzocitrat dehidrogenaza (IDH) je encim, ki katalizira oksidativno dekarboksilacijo izocitrata v α-ketoglutarat ter predstavlja enega izmed encimov Krebsovega cikla. Reakcija, ki jo katalizira izocitrat dehidrogenaza, pa predstavlja tudi eno izmed glavnih presnovnih poti nastanka molekule NADPH – pomembnega celičnega reducenta. Različice v genih IDH so pretežno somatske in se nahajajo v ključnih argininih v aktivnem mestu, ki so odgovorni za vezavo substrata izocitrata – to so R132 v IDH1 ter R140 in R172 v IDH2. Mutiran encim izocitrat dehidrogenaza pridobi neomorfno funkcijo; katalizira pretvorbo α-ketoglutarata v onkometabolit 2-hidroksiglutarat. Posledice tega pa so metabolne spremembe, hipermetilacija DNA in histonov ter redoks neravnovesje. Različice v IDH1 ali IDH2 se pojavljajo pri 5–7 % bolnikov z mielodisplastičnimi novotvorbami in 20 % bolnikov z akutno mieloično levkemijo. Večinoma se pojavljajo pri starejših, imajo negativen prognostični pomen in so povezane s slabšim celokupnim preživetjem. Hkrati pa imajo različice v genih IDH tudi terapevtski pomen, saj je pri teh bolnikih poleg standardnega načina zdravljenja na voljo tudi tarčno zdravljenje s specifičnimi nizkomolekularnimi zaviralci; ivosidenib za IDH1 in enasidenib za IDH2. Ker je predvsem pri diagnozi akutne mieloične levkemije treba čim prej začeti zdravljenje, potrebujemo hitro metodo za določanje teh različic, za kar je primerna metoda sekvenciranje po Sangerju, s katero pridobimo rezultat že v nekaj dneh. Zato smo v okviru magistrske naloge izvedli validacijo metode sekvenciranja po Sangerju za določanje različice R132 v genu IDH1 ter različic R140 in R172 v genu IDH2, pri čemer smo se osredotočili na primerjavo naše metode z do sedaj uporabljano metodo sekvenciranja naslednje generacije, ki pa je za ta namen preveč časovno zamudna. Dokazali smo 100 % analitično občutljivost, 100 % analitično specifičnost, 100 % natančnost znotraj serije, 100 % natančnost med serijami in 100 % ponovljivost med aparati. Mejo zaznave smo postavili na 15 % mutirane DNA v vzorcu, kar je ustrezno glede na klinično uporabnost, saj imajo bolniki ob diagnozi akutne mieloične levkemije ali mielodisplastičnih novotvorb praviloma občutno višji delež mutirane DNA. Validacija je bila uspešna, saj smo dokazali, da je metoda ustrezna za predviden klinični namen in s tem pripravljena za uporabo v rutinski diagnostiki.20262026-02-10 08:45:35Magistrsko delo/naloga179283sl