Pomen prisotnosti mutacij plazemske prostocelične DNA in DNA zunajceličnih veziklov za napovedovanje kliničnega izida pri bolnikih z rakom trebušne slinavkeZavrtanik Čarni, Hana (Avtor) Dolžan, Vita (Mentor) Tomažič, Aleš (Komentor) rak trebušne slinavketekočinska biopsijaprostocelična DNAzunajcelični vezikliUvod. Rak trebušne slinavke kljub napredku na področju diagnostike in zdravljenja ostaja bolezen s slabo prognozo. Z analizo krožečih oblik DNA v tekočinski biopsiji bi lahko bolje predvideli potek bolezni in posamezniku ustrezno prilagodili zdravljenje. V naši raziskavi smo želeli ovrednotiti vlogo tekočinske biopsije pri zaznavanju za tumor značilnih genetskih sprememb (mutacij), spremljanju odgovora na zdravljenje in napovedovanju kliničnega izida pri bolnikih z rakom trebušne slinavke. Hipoteze. 1. Z analizo prostocelične DNA in DNA zunajceličnih veziklov dosežemo enako uspešnost določanja tumorskih mutacij kot z analizo DNA, izolirane iz ob operaciji odvzetega tumorskega tkiva. 2. Večji delež za tumor značilnih mutacij v prostocelični DNA oziroma DNA zunajceličnih veziklov pred resekcijo tumorja odraža večjo razširjenost oz. neresektabilnost tumorja in je povezan s slabšim celokupnim preživetjem. 3. Po radikalni resekciji tumorja v prostocelični DNA oziroma DNA zunajceličnih veziklov ne zaznamo za tumor značilnih mutacij, prisotnost za tumor značilnih mutacij v prostocelični DNA oziroma DNA zunajceličnih veziklov pa omogoča zgodnje zaznavanje ponovitve ali napredovanja bolezni. Metode. V raziskavo smo vključili 83 bolnikov s histološko potrjenim rakom trebušne slinavke, ki so bili operirani z namenom kirurške resekcije tumorja. Bolnikom smo pred operacijo ter na kontrolnih pregledih en, šest in dvanajst mesecev po operaciji odvzeli vzorce krvi, iz katerih smo izolirali prostocelično DNA in DNA zunajceličnih veziklov. Kot referenčne vzorce za iskanje za tumor značilnih mutacij smo uporabili arhivirane vzorce tumorskega tkiva, odvzetega ob operaciji, fiksirane v formalinu in vklopljene v parafin. V izolatih DNA smo določili prisotnost in delež najpogostejših za tumor značilnih mutacij v genih KRAS, TP53, SMAD4 in CDKN2A. Molekularno-genetske analize smo izvedli s pomnoževanjem tarčnih odsekov DNA s kompetitivno alelno-specifično verižno reakcijo s polimerazo (castPCR) in z digitalno verižno reakcijo s polimerazo (dPCR). Rezultati. S castPCR smo v DNA, izolirani iz tumorskega tkiva, najpogosteje zaznali mutaciji KRAS p.G12D in TP53 p.R273H. Ti mutaciji smo izbrali za nadaljnjo analizo DNA iz tumorskega tkiva in longitudinalnih vzorcev prostocelične DNA z dPCR. Izolacijo in analizo DNA zunajceličnih veziklov smo izvedli v podskupini 10 izbranih bolnikov, vendar zaradi majhnega števila izoliranih kopij analiza DNA ni bila uspešna. V prostocelični DNA smo ob operaciji izbrani mutaciji zaznali pri manjšem deležu bolnikov kot v tumorskem tkivu. Zaradi nizkega deleža mutacij v prostocelični DNA nismo zaznali statistično značilne povezave med deležem izbranih mutacij v DNA iz tumorskega tkiva in prostocelični DNA ob operaciji. Delež mutacij v prostocelični DNA je bil ob operaciji deloma povezan s predoperativno razširjenostjo bolezni. Delež mutacij v longitudinalnih vzorcih prostocelične DNA ni kazal jasne povezanosti s kliničnim potekom bolezni. Zaključek. S tekočinsko biopsijo nismo mogli v celoti nadomestiti analize tkivne DNA, še zlasti pri omejeni bolezni. Večji delež mutacij v prostocelični DNA ob operaciji je sovpadal z večjo razširjenostjo bolezni, ni pa bil povezan s preživetjem. Delež mutacij v prostocelični DNA tudi ni bil uporaben za spremljanje poteka bolezni. Izsledki naše raziskave v okviru uporabljene metodologije ne podpirajo uporabe tekočinske biopsije z analizo krožečih oblik DNA pri obravnavi bolnikov z rakom trebušne slinavke.20262026-02-08 07:15:18Doktorsko delo/naloga179214sl