Preučevanje interakcij med biološkimi učinkovinami in pomožnimi snovmi z uporabo spektroskopskih metod na osnovi magnetne resonance in simulacij molekulske dinamikeLebar, Blaž (Avtor) Pajk, Stane (Mentor) Mravljak, Janez (Komentor) Biološka zdravilarazvoj formulacijinterakcijepufripolisorbatirazgradnjajedrska magnetna resonancaelektronska paramagnetna resonancamolekulska dinamikaanaliza glavnih komponent.Razvoj formulacije biofarmacevtskih izdelkov je preko natančnega izbora pomožnih snovi namenjen med drugim temu, da odpravi ali minimizira kemične nestabilnosti, poveča konformacijsko stabilnost in koloidno stabilnost proteinov ter optimizira medfazno nestabilnost. Proteini, v našem primeru monoklonska protitelesa, so lahko podvrženi kompleksnim razgradnim potem ter spremembam ne le primarnih, temveč tudi višjih struktur. Področje pomožnih snovi obsega pufre, stabilizatorje, soli, antioksidante ter površinsko aktivne snovi. Izbor le-teh v biofarmacevtskem razvoju je v preteklosti temeljil na sistematskem preizkušanju in ugotavljanju nekompatibilnosti, vendar pa v zadnjem času nastaja potreba po vedno bolj racionalnih pristopih, ki so v kompetitivnem okolju s svojo učinkovitostjo še kako zaželeni. V okviru doktorskega dela smo identificirali alternativne pufrne sisteme, ki lahko v razvoju predstavljajo možnosti, ki so enako dobre, če ne celo boljše od konvencionalno uporabljenih pufrov. Njihovo učinkovitost smo dokazali pri priporočenih, pospešenih in stresnih pogojih shranjevanja, drugih oblikah stresa (tudi svetlobnem stresu in stresu zamrzovanja/odtaljevanja) ter pri nizki in visoki koncentraciji proteina. Preučili smo interakcije med pomožnimi snovmi in monoklonskimi protitelesi kot enega izmed predlaganih stabilizacjskih mehanizmov. Uporabili smo metode 1D in 2D jedrske magnetne resonance (NMR) ter simulacije molekulske dinamike (MD). Da bi zagotovili ustrezno ločljivost meritev NMR smo modelno monoklonsko protitelo razcepili na Fab in Fc domeni s cisteinsko proteazo IgdE, ter fragmenta očistili s pomočjo preparativne afinitetne kromatgrafije (ALC) in velikostno izključitvene kromatografije (SEC). Nestabilnost Fc fragmenta smo naslovili z uporabo konvencionalnih pufrov in stabilizatorjev, ter podprli s simulacijami MD. Amidne in metilne prstne odtise, pridobljene z metodami 2D NMR, smo dodatno podkrepili s kemometričnimi metodami analize glavnih komponent (PCA) ter kombiniranim odstopanjem kemijskega premika (CCSD), in s tem pokazali, da so metode dovolj občutljive za identifikacijo interakcij ne le s pufri, temveč tudi polisorbati. Interakcije s polisorbati so predstavljale večji izziv, predvidoma zaradi šibkosti interakcije, zaradi česar smo se zatekli k sintezi spinsko označenega polisorbata (SLPS), ki je strukturno zelo podoben polisorbatu (PS) 80 in 20, običajno uporabljenima površinsko aktivnima snovema v biofarmacevtiki. Interakcija med PS80 in modelnim mAb je bila predpostavljena kot verjetna zaradi zaščitnega učinka pred kemično hidrolizo surfaktanta, ki smo ga opazili v njuni koformulaciji. SLPS nam je omogočal tudi uporabo metode elektronske paramagnetne resonance (EPR) ter učinka ojačitve paramagnetne relaksacije (PRE) pri meritvah NMR. Z obema metodama smo pokazali, da SLPS tvori interakcijo z modelnim mAb ter da je interakcija zares šibka, saj smo interakcijo v primeru meritev EPR opazili le ob dodatku saharoze, s čimer smo povečai viskoznost raztopine. Naše izsledke smo podkrepili s simulacijami MD in pokazali, da gre najverjetneje za hidrofobno interakcijo v pregibni regiji mAb, na kar nakazujejo tudi naši podatki stabilnosti PS v prisotnosti fragmentov. Nazadnje smo okarakterizirali še kemijsko hidrolizo PS80 v histidinskem in acetatnem pufru, predlagali mehanizem razgradnje ter pokazali, da plastična primarna ovojnina močno vpliva na razpad. Rezultate smo podprli z metodo PCA. Naši izsledki postavljajo nov kamenček v mozaik razumevanja stabilizacijskih in razpadnih procesov v bioloških formulacijah in predstavljajo nov korak v smer racionalnega razvoja bioloških formulacij.20252025-12-21 07:16:25Doktorsko delo/naloga177352sl