Priprava razredčene krvi za določanje zunajceličnih veziklov z interferometrično svetlobno mikroskopijoŠkof, Anej (Avtor) Kralj-Iglič, Veronika (Mentor) Lampe, Tomaž (Recenzent) diplomska delaortotika in protetikazunajcelični vezikliinterferometrična svetlobna mikroskopijacentrifugiranjeredčenjehidrodinamski premerUvod: Zunajcelični vezikli (ZV) so majhni, z membrano obdani delci, ki igrajo ključno vlogo v medcelični komunikaciji. Njihova analiza, kljub naraščajočemu pomenu, zaradi tehničnih omejitev pri pripravi vzorcev še vedno predstavlja velik izziv. Interferometrična svetlobna mikroskopija (ILM) je obetavna metoda za določanje ZV, vendar zahteva natančno optimizacijo postopkov redčenja in centrifugiranja vzorcev krvi. Namen: Glavni cilj raziskave je bil določiti optimalne pogoje za pripravo vzorcev krvi za analizo ZV z ILM, s poudarkom na vplivu različnih stopenj redčenja in centripetalnih pospeškov rotorja centrifuge. Posebej smo želeli preveriti hipotezo, ki pravi, da centrifugiranje pri pospeških do 1000 g (kjer je g = 10 m/s2) ne vpliva bistveno na številsko gostoto in hidrodinamski premer ZV. Metode dela: V študiji smo uporabili vzorce krvi treh darovalcev. Vzorci so bili razredčeni s fiziološko slanico v razmerjih 2×, 5×, 10× in 20× ter centrifugirani pri petih različnih centripetalnih pospeških rotorja centrifuge (1g, 50g, 500g, 1000g in 10 000g). Molekulsko sestavo supernatantov smo ovrednotili s spektrofotometrijo v ultravijoličnem in vidnem območju (UV-vis) pri valovnih dolžinah 280 nm in 260 nm. Rezultati: Številska gostota ZV se je povečevala z večanjem centripetalnega pospeška rotorja centrifuge do 500 g, kjer je dosegla maksimum, nato pa se je pri višjih pospeških zmanjšala zaradi posedanja ZV. Hidrodinamski premer ZV (povprečno 120-130 nm) se ni statistično značilno spreminjal z različnimi centripetalnimi pospeški rotorja centrifuge. Pri nizkih stopnjah razredčenja (<10×) smo opazili navidezno povečanje hidrodinamskega premera, kar pripisujemo gostejši raztopini. Razmerje absorbanc A280/A260, ki odraža relativno vsebnost beljakovin in nukleinskih kislin, se ni spreminjalo niti z različnimi stopnjami razredčenja niti z različnimi centripetalnimi pospeški rotorja centrifuge. Razprava in zaključek: Rezultati so potrdili našo hipotezo, da centrifugiranje pri centripetalnih pospeških rotorja centrifuge do 1000g ne vpliva bistveno na lastnosti ZV. Kot optimalne pogoje za pripravo vzorcev krvi za analizo ZV z ILM predlagamo centrifugiranje pri 500g in začetno 10-kratno razredčenje. Te ugotovitve so pomembne za standardizacijo metodologije v kliničnih raziskavah ZV, čeprav študija zaradi majhnega števila vzorcev zahteva nadaljnjo potrditev na večji kohorti. Poleg tega naše ugotovitve kažejo, da je pri nizkih stopnjah razredčenja treba upoštevati potencialne artefakte pri merjenju hidrodinamskega premera.[A. Škof]20252025-11-07 07:45:36Diplomsko delo/naloga175768sl