Priprava na novo načrtanih proteinov za vezavo na MLKLKozel, Vid (Avtor) Gunčar, Gregor (Mentor) MLKLkloniranje IVAvezavni proteinN-končna domena MLKL (ang. mixed lineage kinase-domain like protein) vsebuje sveženj štirih α vijačnic (4HB) in je ključna za indukcijo permeabilizacije membrane ter sprožitev nekroptoze. Ta domena sama po sebi zadošča za izvedbo nekroptotičnega procesa, pri čemer C-končna vijačnica (H6) deluje kot regulatorni element efektorske funkcije proteina. S preučevanjem interakcij med raznimi načrtanimi proteinskimi vezalci in N-končnim delom proteina MLKL smo poiskali najbolj primernega in ga izrazili. Izbrani protein imenovan GGNB MLKL BIND 005 smo s kloniranjem IVA uvedli v ekspresijski vektor PMCSG7 M33 APEX2 ter uspešnost vstavljanja inserta preverili z določanjem nukleotidnega zaporedja. S poskušanjem izražanja v E. coli seva BL21 [DE3]pLysS pri različnih temperaturah smo po NaDS PAGE analizi vzorcev ugotovili, da se fuzijski protein najbolje izraža pri 25 °C. Te pogoje smo uporabili za izražanje v večjem merilu. Protein smo uspešno izolirali, odstranili N-končno heksahistidinsko oznako ter opravili imunodetekcijo s primarnimi mišjimi monoklonskimi protitelesi proti c-Myc ter sekundarnimi HRP konjugiranimi kozjimi protitelesi proti mišjim IgG in IgM. Vezave fuzijskega proteina na MLKL-154 s točkovnim prenosom nismo dokazali.20252025-10-09 07:53:07Diplomsko delo/naloga174738sl