Vpliv zamenjave pregibne in transmembranske domene na delovanje himernega antigenskega receptorjaKirn, Neža (Avtor) Fink, Tina (Mentor) Gaber, Aljaž (Komentor) imunoterapija rakahimerni antigenski receptorpregibna domenatransmembranska domenaTerapija s spremenjenimi celicami T, ki imajo na površini izražen himerni antigenski receptor (CAR, angl. chimeric antigen receptor) je oblika celične terapije za zdravljenje hematoloških rakavih obolenj, pri kateri se bolnikove limfocite T v laboratoriju gensko spremeni tako, da prepoznajo in ubijejo rakave celice, ki izražajo specifični tarčni antigen. CAR sestavljajo štiri glavne komponente: zunajcelična antigen-vezavna domena, pregibna domena, transmembranska (TM) domena in vsaj ena znotrajcelična signalna domena. Dosedanje raziskave se osredotočajo predvsem na vpliv kostimulatornih domen na aktivacijo celic CAR-T. V okviru magistrskega dela pa smo raziskovali vpliv pregibne in TM domene na funkcionalnost celic CAR-T, saj je znano, da imata le-ti pomembno vlogo pri izražanju CAR na površini celic in znotrajcelični signalizaciji ter posledično vplivata na izločanje citokinov. Z uporabo metod molekulskega kloniranja smo v celicah E. coli pripravili genske konstrukte CAR, ki so vsebovali različne kombinacije nativnih in alternativnih pregibnih in TM domen. Nato smo jih z elektroporacijo oz. z lentivirusno transdukcijo vnesli v celično linijo Jurkat E6.1. Izražanje in funkcionalnost konstruktov v kokulturi z rakavimi celicami Raji smo analizirali s pretočno citometrijo, konfokalno mikroskopijo in encimskoimunskim testom (ELISA). Pokazali smo, da pregibna in TM domena vplivata tako na izražanje CAR na površini celic, kot tudi na stopnjo izražanja človeškega interlevkina 2 (hIL-2) po stimulaciji s tumorskimi celicami. S pripravljenimi genskimi konstrukti CAR smo transducirali tudi celice Jurkat TPR. Le-te stabilno izražajo tri reporterske proteine, ki omogočajo sočasno določanje aktivnosti treh transkripcijskih faktorjev (NF-κB, NFAT in AP-1), ki imajo ključno vlogo v aktivaciji celic CAR-T. Po stimulaciji transduciranih celic s tumorskimi celicami smo s pretočno citometrijo pokazali, da se aktivirajo signalne poti vseh treh ključnih transkripcijskih faktorjev. Določene kombinacije alternativnih domen pa glede na komercialno uporabljene domene lahko okrepijo prenos signalov v celicah CAR-T. Naši rezultati so pokazali, da izbira pregibne in TM domene CAR pomembno vpliva na učinkovitost in varnost terapije CAR-T, v nadaljnjih raziskavah pa bi bilo treba natančneje ovrednotiti klinični potencial posameznih domen oz. genskih konstruktov z izvedbo eksperimentov na primarnih celicah T.20252025-09-25 12:45:01Magistrsko delo/naloga173977sl