Optimizacija in validacija PCR v realnem času za diagnostiko humane ehinokokozeCep, Pia (Avtor) Šoba Šparl, Barbara (Mentor) Keše, Darja (Recenzent) zoonozeparazitihumane ehinokokozeEchinococcus spp.PCR v realnem časuvalidacijaoptimizacijamolekularne tehnikeTrakulje iz rodu Echinococcus povzročajo eno od najpomembnejših parazitoz, ehinokokozo. Ljudje smo naključni vmesni gostitelji larvalnih oblik trakulj iz kompleksa vrst Echinococcus granulosus sensu lato, ki so povzročiteljice cistične ehinokokoze, ter vrste Echinococcus multilocularis, povzročiteljice alveolarne ehinokokoze. Okužba je običajno več let asimptomatska, dokler larvalna oblika, ki se razvije predvsem v jetrih, ne zraste do te mere, da povzroči simptome s pritiskom na tkiva ali s širjenjem larvalnih metastaz. Zaradi težke prepoznavnosti bolezni je zanesljiva diagnostika ključna za pravočasno odkrivanje ter učinkovito obvladovanje bolezni. V Laboratoriju za parazitologijo Inštituta za mikrobiologijo in imunologijo Medicinske fakultete Univerze v Ljubljani se pri molekularni diagnostiki ehinokokoze trenutno uporablja klasični PCR in sekvenciranje pridelkov PCR, kar je časovno zamudno, precej drago in občutljivo za kontaminacijo s pridelki predhodnih reakcij PCR. V naši nalogi smo optimizirali in validirali PCR v realnem času za ugotavljanje DNK Echinococcus spp. v kliničnih vzorcih in določitev vrste povzročiteljice ehinokokoze pri človeku. PCR v realnem času smo optimizirali s prilagajanjem koncentracij začetnih oligonukleotidov in sond ter validirali z določitvijo meje zaznavnosti, ponovljivosti, obnovljivosti ter diagnostične specifičnosti in občutljivosti. Meja zaznavnosti (LOD95) za E. granulosus sensu stricto je 0,7028 ng/µL, za E. canadensis 0,00048 ng/µL in za E. multilocularis 0,00013 ng/µL. Test se je tekom validacije pokazal kot ponovljiv, obnovljiv ter 100% občutljiv in 100% specifičen, brez navzkrižnih reakcij med vrstami znotraj rodov Echinococcus in Taenia. PCR v realnem času se je izkazal kot primeren za hitro diagnostiko humane ehinokokoze, ki je glede specifičnosti in občutljivosti primerljiv s klasičnim PCR in sekvenciranjem, pri čemer pa njegova validacija ostaja kontinuiran proces, ki zahteva nadaljnje preverjanje učinkovitosti in zanesljivosti.[P. Cep]20252025-09-17 07:16:47Magistrsko delo/naloga173377sl