Interakcije monoklonskega protitelesa iMab z nukleotidnimi zaporedji DNA, bogatimi s citoziniValte, David (Avtor) Plavec, Janez (Mentor) i-motiviMabNMR spektroskopijaI-motivi so nekanonične strukture DNA, ki nastajajo v nukleotidnih zaporedjih, bogatih s citozini. Tvorijo se v kislih pogojih, kjer protonirani citozinski ostanki tvorijo hemiprotonirane C•C⁺ bazne pare. Zaradi svoje dinamičnosti in reverzibilne narave igrajo pomembno vlogo pri regulaciji celičnih procesov transkripcije, podvajanja DNA in epigenetskih modifikacijah. Imunoprecipitacijske študije na podlagi vezave monoklonskih protiteles na jedrno DNA kažejo, da se i-motivi lahko tvorijo in vivo. Najpogosteje uporabljeno protitelo pri takšnih raziskavah je iMab, ki je bil razvit proti i-motivu, katerega tvori telomerno zaporedje hTeloC (CCCTAACCCTAACCCTAACCCT). iMab je enoverižni fragment človeškega monoklonskega protitelesa, ki se veže na inter- in intramolekularne i-motive. Hkrati iMab ne interagira s strukturami DNA kot so G-kvadrupleksi, dvoverižna DNA, lasnične zanke in z mutiranimi telomernimi zaporedji, ki ne tvorijo i-motivov. V zadnjem času so se pojavili dvomi glede specifičnosti iMab protitelesa za i-motive v primerjavi z nezvitimi s citozini bogatimi DNA zaporedji. Zato smo s spektroskopskimi metodami vključno z NMR, CD in DLS spektroskopijo karakterizirali funkcionalno stanje proteina iMab ter interakcijo med proteinom iMab in i-motivom. Rezultati so pokazali, da se telomerno zaporedje hTeloC zvije v stabilno i-motivno strukturo v pH območju 5,4–6,0. Fosfatni pufer je omogočil tudi najboljše ločevanje signalov v NMR spektrih. Naši eksperimenti potrjujejo, da je v fosfatnem pufru pri pH vrednostih od 5,4 do 6,0 iMab nativno zvit in pretežno monomeren. iMab prepoznava tridimenzionalno strukturo DNA zaporedja hTeloC ter z njo interagira odvisno od lokalnega okolja ali sestave raztopine, v kateri se nahaja. Določili smo KD za interakcijo med iMab in i-motivom, ki je v fosfatnemu pufru pri pH 5,4 znašala 47,8 μM. Identificirali smo regije i-motiva, ki sodelujejo v interakciji s proteinom. Za interakcijo so najpomembnejše zanke i-motiva. Največji prispevek k interakciji so imeli ostanki T10, A11 in A12, ki se nahajajo v isti zanki, ter T22, ki se prav tako nahaja prostorsko blizu te zanke.20252025-09-15 13:35:00Magistrsko delo/naloga173299sl