Načrtovanje in priprava samosestavljivih proteinskih polimerov na osnovi spektrinskih domenStell Pičman, Adrian Samuel (Avtor) Jerala, Roman (Mentor) spektrinske ponovitvedistrofinovite vijačnicesamosestavljanjeproteinski polimeriV sklopu raziskovalne naloge smo zasnovali modularne proteinske gradnike na osnovi spektrinskih ponovitev in ortogonalnih peptidov, ki tvorijo motive ovitih vijačnic (OV) z namenom, da se lahko samo-sestavijo v geometrijsko urejene visokomolekularne strukture. Izhajajoč iz para Dy3BB53:46, ki tvori filamente, smo zasnovali spremenjene različice proteinskih gradnikov, ki vsebujejo več peptidov OV. Z načrtno postavitvijo peptidov v proteinsko strukturo, smo predvideli samo-sestavljanje v premrežene oziroma razvejane strukture. Proteine smo proizvedli v E. coli in jih očistili z afinitetno kromatografijo Ni-NTA (NiNTA) ter z kromatografija z ločevanjem po velikosti (SEC). Nato smo jih karakterizirali z poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS-PAGE) in spektroskopijo cirkularnega dikroizma (CD). Polimerizacijo smo sprožili z dializo ali mešanjem predhodno dializiranih komponent. Dializo smo izvedli za zmanjšanje koncentracije soli in odstranitev glicerola. Kinetiko samo-sestavljanja in velikost struktur v raztopini smo spremljali z dinamičnim sipanjem svetlobe (DLS), poliakrilamidno gelsko elektroforezo v nativnih pogojih (nativna-PAGE) pa smo uporabili za potrditev tvorbe visokomolekularnih struktur. Z mikroskopijo na atomsko silo (AFM), interferenčno odbojno mikroskopijo (IRM) in fluorescenčno mikroskopijo s popolnim notranjim odbojem (TIRFM) smo razkrili raznolike in kompleksne samo-sestavljene strukture, vključno s filmi, razvejanimi filamenti in premreženji. Tako potrjujemo hipotezi, da se zasnovani proteini samo-sestavijo v visokomolekularne strukture in da so omenjene visokomolekularne strukture bistveno bolj razvejane in/ali premrežene od struktur, ki jih tvori izhodiščni proteinski par Dy3BB53:46. Z meritvijo AFM smo dokazali, da sušenje, kristalizacija soli in mehanske sile, povzročene zaradi spiranja, lahko vplivajo na končno obliko proteinskih struktur. Trenutno pomanjkljivo razumemo vpliv pogojev priprave vzorcev na končno morfologijo visokomolekularnih struktur. Kljub temu raziskava predstavlja obetaven korak k načrtovanju kompleksnih bioloških polimerov z načrtovano arhitekturo.[ A. S. Stell Pičman]20252025-09-13 08:15:39Magistrsko delo/naloga173119sl