Kloniranje in izražanje proteina toplotnega šoka Grp94Duša, Žiga (Avtor) Pečar Fonović, Urša (Mentor) Cingl, Jernej (Komentor) rakproteini toplotnega šokaGrp94izražanje v E. coli NiCo21 (DE3)termoforeza na mikroskaliProteini toplotnega šoka (Hsp) sodelujejo pri zvijanju mnogih celičnih proteinov in so posredno vpleteni v razvoj različnih bolezni. Družina Hsp90 ima številne t.i. proteine kliente, ki so se izkazali za onkogene. V endoplazemskem retikulumu se nahaja z glukozo reguliran protein, velik 94 kDa (Grp94), ki je ena od izooblik družine Hsp90. Selektivno zaviranje omenjene izooblike bi vplivalo na zvijanje nekaterih onkogenih proteinov brez vpliva na delovanje drugih izooblik Hsp90. Namen magistrske naloge je bil klonirati gen HSP90B1, izraziti človeški protein Grp94 ter določiti vezavno afiniteto dveh spojin do Grp94 – znanega neselektivnega zaviralca, ki deluje na C-končno domeno, novobiocina in spojine UL-Hsp90 1. Slednja je bila pripravljena na Fakulteti za farmacijo, Univerze v Ljubljani za namene zaviranja članov družine Hsp90 na C-končni domeni. Gen HSP90B1 smo vstavili v bakterijski ekspresijski vektor pET28. Po neuspešnem klasičnem molekulskem kloniranju smo z metodo sestavljanja po Gibsonu uspešno pripravili konstrukt pET28, ki je vseboval gen HSP90B1. Izražanje smo inducirali v sevu E. coli NiCo21 (DE3). Za uspešno biosintezo celotnega Grp94 je bila potrebna sočasna transformacija bakterij s plazmidom pRARE2, ki zagotavlja prenašalne ribonukleinske kisline za kodone, redke v izbranem bakterijskem sevu. Optimizirali smo tudi pogoje izražanja in določili, da za ekspresijo zadostuje 0,1 mM koncentracija izopropil-β-D-1 tiogalaktopiranozida v gojišču 2× YT in pri temperaturi izražanja 16 °C. Izolacija proteina je potekala v dveh korakih: najprej z nikelj – kelatno afinitetno kromatografijo in nato še s kromatografijo z ločevanjem po velikosti. Prisotnost proteina Grp94 smo potrdili z analizo s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecil sulfata in prenosom western, ter njegovo koncentracijo določili z metodo po Bradfordu. Izolirani človeški protein Grp94 smo nato uporabili za določanje vezavne afinitete izbranih spojin z metodo termoforeze na mikroskali. Na Grp94 smo določili vrednost konstante disociacije za novobiocin (217,5 ± 80,17 µM), medtem ko za spojino UL-Hsp90-1 z enako metodo vrednosti nismo uspeli določiti. To pomeni, da se spojina UL-Hsp90-1 na protein Grp94 verjetno ne veže.20252025-09-12 08:45:40Magistrsko delo/naloga173009sl