Priprava in izražanje mutantov človeškega α-aktinina-1Pojbič, Taja (Avtor) Pavšič, Miha (Mentor) aktinα-aktinin-1kalcijkonformacijske spremembeCitoskelet deluje kot osrednja znotrajcelična struktura organizmov. Sestavljen je iz aktinskih filamentov, mikrotubulov in intermediarnih filamentov, sodelujejo pa tudi številni drugi proteini. Med proteini, ki so pomembni za organizacijo aktinskih filamentov, so α-aktinini, ki tvorijo homodimere, sestavljene iz aktin vezavne domene, vratu, paličaste domene v obliki spektrinskih ponovitev in kalmodulinu podobne domene, ki pri nekaterih izooblikah veže kalcijeve ione. α-aktinin-1 je eden najpomembnejših prečnih povezovalcev aktina v fokalnih stikih in stresnih vlaknih; njegova aktivnost naj bi bila regulirana s kalcijem. Podrobnosti konformacijskih sprememb ob vezavi kalcijevega iona so še predmet raziskav, nedavno pa je bil odkrit model regulacije α-aktinina-1 s kalcijevimi ioni [22]. Ob vezavi Ca$^{2+}$ naj bi se α-aktinin-1 postavil v bolj zaprto konformacijo, s čimer se spremeni način povezovanja aktinskih filamentov. Za namen analize konformacijskih sprememb ob vezavi kalcija in vpliva α-aktinina-1 k prečnemu povezovanju aktinskih filamentov smo pripravili in izrazili osem mutantov: štiri polovičnega dimera in štiri divjega tipa proteina. Osredotočili smo se predvsem na interakcije med domeno EF12 z vezanim kalcijevim ionom in paličasto domeno, ki bi jih mutacije povzročile. Trije mutanti divjega tipa proteina so vsebovali enojno mutacijo, ena pa dvojno; enako velja za mutante polovičnega dimera (verigi A in B), ki vsebuje vse funkcionalne domene kot popolen protein divjega tipa α-aktinina-1. Izvajali smo mestnospecifično mutagenezo z reakcijo PCR, ki je bila za vse konstrukte uspešna. Mutante smo nato izrazili v gostiteljskem sevu E. coli Bl21[DE3]pLysS, s čimer smo potrdili, da je ta bakterijski sev ustrezen za izražanje teh mutantov. Na koncu smo izvedli NaDS-PAGE, da smo preverili količino produkta v topni frakciji in dokazali, da se mutanti α-aktinina-1 pretežno izražajo v topni obliki.20252025-09-08 12:55:00Diplomsko delo/naloga172546sl