Uporaba lipidnih nanodelcev za dostavo izboljšanega sistema CRISPR/Cas za tarčno integracijo transgena CD19-CAR v limfocite T pri imunoterapiji rakaSotošek, Timotej (Avtor) Lainšček, Duško (Mentor) Dolinar, Marko (Komentor) CCExoLNPCAR-T in vivoCRISPR/Cas9imunoterapija rakatarčna integracijaNov preboj zdravljenja raka se je zgodil znotraj imunoterapije, ko so bile celice CAR-T predstavljene kot od komponent MHC neodvisna adaptivna T-celična terapija za zdravljenje B-celičnih neoplazij. Priprava celic CAR-T običajno poteka z zunanjo spremembo pacientovih avtolognih limfocitov T z virusnimi vektorji, pri čemer je integracija dostavljenega transgena v genom naključna. Posledice tega so lahko insercijske mutageneze, kar povzroča stranske učinke terapije, med drugim aktivacijo onkogenov ter poslabšanje celičnega produkta. Rešitev slednjih nevšečnosti leži v uporabi sistema CRISPR/Cas, ki omogoča tarčno vstavitev terapevtskega transgena v genom. Namen magistrskega dela je priprava kodirajočega zaporedja za transgen CD19 CAR ter drugih ključnih komponent za delovanje izboljšanega sistema CRISPR/Cas, CCExo. Omenjene komponente smo nato z nevirusnim vnosom (elektroporacija, lipidni nanodelci) dostavili v človeške celice CD3(+) z namenom razvoja celic CAR-T in vitro. V eksperimentalnem delu smo uspešno pripravili komponente CCExo v obliki mRNA in gRNA TRAC in vitro ter te skupaj s transgenom za humani CD19 CAR v obliki DNA vnesli v človeške celice CD3(+) z elektroporacijo. Uspešnost priprave celic CAR T smo dokazali s citometrijo, njihovo funkcionalnost pa z spremljanjem tarčne citotoksičnosti in citokinskega profila. Nadalje smo komponente za generacijo celic CD19 CAR-T zapakirali v lipidne nanodelce (LNP). Te smo za učinkovitejšo dostavo v celice T konjugirali s protitelesi proti humanemu površinskemu označevalcu celic T, CD5. Po uspešnem dokazu dostave komponent CCExo in transgena z LNP s prej naštetimi metodami smo poskuse nadaljevali in vivo. V humanizirane miši smo injicirali prej omenjene LNP z namenom tvorbe celic CD19 CAR-T v živem organizmu brez potrebe predhodne zunanje modifikacije celic T. Po enem tednu od injiciacije LNP smo iz miši izolirali kri in vranice ter s prej omenjenimi metodami dokazali, da smo uspešno pripravili celice CAR-T in vivo. S poskusi smo pokazali, da je sistem CCExo v kombinaciji z LNP bolj učinkovit pri pripravi celic CAR-T in vitro ter in vivo kot klasični sistem CRISPR/Cas9.20252025-09-05 12:55:00Magistrsko delo/naloga172093sl