Pomen fenilalanina za vezavo proteina TDP-43 na male RNAKovaček, Lucija (Avtor) Rogelj, Boris (Mentor) TDP-43izražanje proteinain vitro transkripcijatermoforeza na mikroskalimale RNATDP-43 je RNA- in DNA-vezavni protein, ki veže trans-aktivacijski odzivni element DNA. Ključen je pri regulaciji metabolizma RNA, prenosu mRNA, sintezi stresnih granul in pri drugih celičnih procesih. Običajno se TDP-43 nahaja v topni obliki, pri nekaterih nevrodegenerativnih boleznih, kot sta amiotrofična lateralna skleroza (ALS) in frontotemporalna demenca (FTD), pa se kopiči v citoplazmi v obliki netopnih inkluzijskih telesc. Protein TDP-43, ki ga uvrščamo v družino heterogenih jedrnih ribonukleoproteinov (hnRNP), je sestavljen iz N-končne domene (NTD), dveh RNA-prepoznavnih motivov RRM1 in RRM2 ter iz neurejene C-končne domene (CTD). Vsebuje tudi jedrni lokalizacijski signal (NLS), signal za prenos iz jedra (NES) in več signalov za prenos v mitohondrije. Pri vezavi proteina TDP-43 na nukleinske kisline ima pomembno vlogo motiv RRM1, ki v zaporedju prepozna ponovitve UG oz. TG, motiv RRM2 pa poveča samo specifičnost vezave. V motivu RRM1 sta bistvena dva fenilalaninska aminokislinska ostanka, ki sodelujeta v π-π interakcijah nalaganja. V CTD se nahaja še osem fenilalaninov, ki mogoče tudi pomagajo pri stabilizaciji interakcije z RNA. V diplomskem delu smo v bakterijskem ekspresijskem sistemu T7 z avtoindukcijo izrazili protein TDP-43 in njegove mutante, kjer so bili v C-končni domeni in v motivih RRM1 ter RRM2 določeni fenilalaninski aminokislinski ostanki mutirani v levcinske. Proteine smo očistili z Ni$^{2+}$-afinitetno kromatografijo. Izvedli smo tudi in vitro transkripcijo malih RNA, ki smo jih uporabili pri analizi vezave proteinov na RNA z metodo termoforeze na mikroskali (MST).20252025-09-01 12:45:00Diplomsko delo/naloga171744sl