Vpliv proregije na stabilnost in aktivnost rekombinantnega pernizinaSteiner, Živa (Avtor) Poklar Ulrih, Nataša (Mentor) Bahun, Miha (Komentor) Pernizinproteazarekombinantni proteinproregijaproteolitična aktivnosttermostabilnostPernizin je subtilizinu podobna alkalna endopeptidaza iz hipertermofilne arheje Aeropyrum pernix, znana po izjemni termostabilnosti in zmožnosti razgradnje prionov. Podobno kot bakterijski subtilizin se tudi pernizin v arheji sintetizira kot neaktivni prekurzor in potrebuje pomoč N-terminalne pro-sekvence (proregije) za zvitje v zreli encim. Ta pri subtilizinu deluje ne le kot inhibitor, ki pred odcepom inhibira aktivno mesto encima, temveč tudi kot molekularni šaperon, ki omogoča pravilno zvijanje katalitične domene. Zvitje pernizina pa za razliko od subtilizina, katerega zvitje je povsem odvisno od šaperonskega delovanja proregije, omogočijo ioni Ca2+, ki se vežejo v osem mest na katalitični domeni. Že vzpostavljeni postopki sinteze rekombinantnega pernizina v bakterijah Escherichia coli in Streptomyces rimosus brez proregije so pokazali, da ta ohrani visoko termostabilnost in aktivnost za preproste substrate. V diplomski nalogi smo preverili, ali poleg ionov Ca2+ tudi proregija v določeni meri vpliva na konformacijo, stabilnost in aktivnost katalitične domene pernizina. Uspešno smo sintetizirali pernizin s proregijo v bakterijah E. coli, medtem ko sinteza pernizina brez proregije ni bila uspešna. Zato smo se osredotočili na in vitro zvijanje aktiviranega pernizina z in brez proregije po predhodni denaturaciji. Z uporabo različnih metod, kot so diferenčna dinamična fluorimetrija, spektroskopija s cirkularnim dikroizmom, fluorescenčna emisijska spektrometrija in razgradnja kompleksnega substrata, smo analizirali konformacijo, stabilnost in proteolitično aktivnost obeh in vitro zvitih različic. Proregija ni pokazala pomembnega vpliva pri nobeni od analiz, torej ne vpliva na nobeno od navedenih lastnosti. Rezultati analiz potrjujejo prejšnja predvidevanja, da proregija deluje le kot inhibitor, ne pa tudi kot šaperon za katalitično domeno.20252025-08-31 07:16:06Diplomsko delo/naloga171704sl