Izolacija adeno-asociacijskih virusov iz lizatov trajne celične kulture hek 293 s pomočjo monolitnih nosilcevPrimc, Viktorija (Avtor) Narat, Mojca (Mentor) Tajnik Sbaizero, Mojca (Komentor) rAAVbiotehnologijagenska terapijamasna fotometrijamonolitionsko izmenjevalna kromatografijaPATfixV genski terapiji se za vnos genskega materiala uporabljajo virusni vektorji, med katerimi so rAAV eni najpogosteje uporabljenih. Z namenom izboljšanja njihovih lastnosti, kot sta tropizem in učinkovitost transdukcije, se s pomočjo genskega inženiringa nenehno razvijajo nove različice kapsid rAAV za uporabo v terapevtske namene. Ključno je doseči visok delež polnih vektorjev rAAV, ki vsebujejo terapevtske gene, na kar močno vpliva tudi postavitev ustreznih pogojev v pripravljalnih procesih. Zaradi lažjega spremljanja in izbire najbolj optimalnega serotipa rAAV in parametrov tekom pripravljalnih procesov obstaja potreba po razvoju hitrega, enostavnega in stroškovno učinkovitega protokola čiščenja virusnih vektorjev na majhni skali, ki bi imel možnost avtomatizacije in kasnejšega prehoda na industrijsko raven. V magistrskem delu smo preučevali različne korake protokola za izolacijo serotipov rAAV2, rAAV8, rAAV9. Določili smo delež, potreben za zakisanje celičnega lizata kulture HEK 293, definirali elucijski volumen virusa in določili kapaciteto oz. volumen nalaganja vzorca na monolitni nosilec ter testirali različne predpriprave lizatov HEK 293 tekom pripravljalnih procesov. Preučevali smo dva različna vezavno-elucijska pogoja, gradient pH in pH-NaCl, z namenom izboljšanja vezave rAAV na monolitne nosilce ter zmanjšanja količine nečistot v elucijskih frakcijah. Po posameznem koraku v procesu razvoja protokola smo naredili analizo količine produkta in čistosti vzorcev z različnimi analitskimi metodami: PATfix, masna fotometrija, BCA, Picogreen in SDS-PAGE. Protokol izolacije rAAV iz lizatov celičnih kultur HEK 293 se je izkazal za robustnejšega, ko smo za elucijski pogoj uporabili gradient pH-NaCl, saj smo z njegovo pomočjo uspešno očistili lizate vseh uporabljenih serotipov rAAV na monolitni mikrotitrski plošči CIM® SO3 0,2 mL s 96 luknjami. Z obema elucijskima pogojema nam je uspelo pridobiti vpogled v deleže polnih kapsid rAAV z uporabo masne fotometrije, ki zahteva določeno stopnjo čistosti in koncentracije virusov.20252025-07-19 07:15:42Magistrsko delo/naloga170868sl