Sinteza in vrednotenje fluorescenčnih sond na osnovi bisbenzimida za označevanje DNAPotočnik, Benjamin (Avtor) Pajk, Stane (Mentor) fluorescencaStokesov premikfluoroforHoechstFluorescenčna mikroskopija omogoča opazovanje analitov, označenih s fluorescenčnimi sondami – molekulami, ki po vzbujanju sevajo svetlobo. Na izbrani analit specifično vezano fluorescenčno sondo vzbudimo s svetlobo valovne dolžine, pri kateri absorbira v največjem obsegu, sevana svetloba pa ima zaradi energijskih izgub daljšo valovno dolžino. Razliko imenujemo Stokesov premik. Za učinkovito znotrajcelično opazovanje mora sonda prehajati celično membrano, se specifično vezati na izbrano celično komponento in se tam zadržati. Proces ne sme biti toksičen za celico, prav tako pa mora biti netoksično tudi samo vzbujanje, ki povzroča spremembe energijskega stanja. Ekstinkcijski koeficient ter kvantni izkoristek opredeljujeta, kako učinkovito sonda izkorišča prejeto svetlobo. Namen naloge je bil izboljšati lastnosti že uveljavljene fluorescenčne sonde Hoechst 33258, ki se specifično veže v mali jarek deoksiribonukleinske kisline (DNA). Njena glavna slabost je potreba po vzbujanju z ultravijolično (UV) svetlobo, kar negativno vpliva na obseg in uspešnost celične delitve. Optimizacijo molekule Hoechst 33258 smo skušali doseči z vezavo že obstoječih ali novo sintetiziranih fluoroforov prek dveh pristopov: s pripenjanjem neposredno na molekulo Hoechst 33258 ali preko različnih distančnikov. Delo smo pričeli s sintezo lastne spojine Hoechst 33258. Sintezna pot je opisana v literaturi, mi pa smo jo uspešno optimizirali za pripravo večjih količin produkta. Sledili so poskusi vezave fluoroforov na pridobljeni Hoechst 33258. Neposredno pripenjanje je bilo neuspešno, medtem ko smo z uporabo distančnika uspešno sintetizirali in izolirali spojino 18. Sinteza je ponovljiva, izolacija produkta pa nezahtevna. Spojino 18 smo uspešno uporabili za označevanje izolirane DNA, pri čemer smo zaznali povečanje fluorescence vezane oblike v primerjavi s prosto molekulo 18. Kasnejši poskusi nanosa spojine 18 na žive celice so pokazali, da molekula ne vstopa v znotrajcelični prostor. Potencial molekule 18 bi lahko izpopolnili z nadaljnjo optimizacijo distančnika ali fluorofora, ki smo ga pripeli na osnovno strukturo Hoechst 33258, in tako dosegli večji obseg vstopa sonde v celico in jedro ter povečali Stokesov premik.20252025-07-06 07:45:33Magistrsko delo/naloga170454sl